3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH
Summary
Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-DNA FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar.
Abstract
3D konfokal mikroskopi ardından 3 boyutlu korunmuş çekirdekleri üzerinde DNA problar kullanılarak floresan in situ hibridizasyon (3D DNA FISH) bireysel hücrelerin alt bölgeler kromozomal gen lokuslarının yeri veya tüm ülkelerle görselleştirmek için en doğru yolu gösterir. Bu tip analiz çekirdeğin küresel mimari gibi nükleer boşluk içinde belirli lokus ve genomik bölgenin davranışının fikir verir. Immunofluorescence, diğer taraftan, nükleer proteinlerin tespiti (modifiye edilmiş histon, histon türevleri ve değiştiriciler, transkripsiyon faktörleri ve makine, nükleer alt-bölme, vb) izin verir. Immünofloresan ve 3B DNA FISH birleştirme içinde önemli bir sorun çekirdeğin 3D mimarisi yanı sıra antikor tarafından tespit edilen epitopu korumak için bir taraftan, ve diğer taraftan, DNA prob nüfuz tespit etmesi için gen lokus veya kromozom bölgeleri 1-5. Burada 3D korunmuş çekirdeklerinde genomik lokus ile kromatin modifikasyonları görselleştirme birleştiren bir protokol sağlar.
Introduction
Epigenetik mekanizmalar tetik kuruluş ve gelişim ve hücre tipi özel transkripsiyonel profilleri kalıtım. Bir düzeyde bu aktif veya sessiz genomik bölgelerde tanımlar kromatin paketlenmesi modülasyonu içerir. Daha büyük ölçekte, genom ve nükleer mimarisinin küresel 3D organizasyonu da transkripsiyonel desen kontrolünde bir rol oynamaktadır. Böylece, bu epigenomic özelliklerin diseksiyonu genler 6-11 düzenlenir nasıl tam bir anlayış için önemlidir.
Kombine immünofloresan ve 3D DNA FISH spesifik etkileşimler / çekirdeğin içinde DNA dizileri ve / veya protein dernekler değerlendirerek, biyokimyasal ve moleküler analizler tamamlamak için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Bunun yanında, bu tür kromatin immünopresipitasyon (ChIP-seq) veya derin dizileme ile birleştiğinde kromozom yakalama konformasyon olarak genom yüksek verimlilik teknikleri (4C-seq, 5C, Hi-C) küresel dat sağlamakhücre popülasyonlarının 12 üzerinde, immünofloresan / DNA FISH teknikleri tek hücre düzeyinde analiz sağlar.
Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar. Bu protokolün avantaj DNA ve protein yapılarının korunması kombine görselleştirme olduğunu. Bu alanda tecrübemiz mevcut protokoller geliştirmek ve kolaylaştırmak için bize sağladı. Bu rekombinasyon geçiren lenfosit çift-sarmallı DNA mola tespit etmek için bu protokol kullanılmıştır, ancak bu yöntem, diğer proteinlere ve diğer hücre türleri uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda ayrıntılı teknikler lenfositler 30,31 geliştirme İmmunoglobulin ve Tcra / d loci V (D) J rekombinasyon düzenleme analiz etmek için, laboratuar kullanılmıştır. Biz bu tekniği farklı hücre tiplerinde çeşitli nükleer proteinler, nükleer bölmeleri ve lokus tespiti için adapte edilebilir eminiz. Protokol değişiklikler gerekli olabilir, ve bu durumda, odaklanmak için önemli adımlar aşağıdaki gibidir. İlk olarak, geçirgenliği uzunluğu hücre tipine bağlı …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz tartışmalar ve yorumlar için Skok laboratuar, özellikle Susannah Hewitt, üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık hibe Ulusal Enstitüsü R01GM086852, RC1CA145746 (JAS) tarafından desteklenmektedir. JAS Bir Lösemi ve Lenfoma Derneği bilgindir. JC Kanser Araştırma Enstitüsü Irvington Enstitüsü üyesidir. MM Ulusal Bilim Vakfı Hibe Bütünleştirici Lisansüstü Eğitim ve Araştırma Staj (NSF IGERT 0333389) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. |
Referenzen
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories–a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus – charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3′ Igk enhancer induces ‘decontraction’ of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus ‘decontraction’ and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
