Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen durch Immunfluoreszenz und DNA-Sequenzen von DNA-FISH durch 3D-Mikroskopie und-Analysen (3D Immuno-DNA FISH) gefolgt.
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Methodenartikel
Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung mit DNA-Sonden auf 3-dimensional erhalten Kerne durch 3D-konfokale Mikroskopie verfolgt (3D DNA FISH) stellt die direkteste Weg, um die Lage der Gen-Loci, chromosomalen Subregionen oder ganze Gebiete in einzelnen Zellen zu visualisieren. Diese Art der Analyse gibt einen Einblick in die globale Architektur des Zellkerns als auch das Verhalten der spezifischen genomischen Loci und Regionen innerhalb der nuklearen Raum. Immunfluoreszenz, auf der anderen Seite erlaubt die Detektion von nuklearen Proteinen (modifizierte Histone, Histon-Varianten und Modifikatoren, Transkription Maschinen und Faktoren, Atom-U-Fächer, etc). Die große Herausforderung in der Kombination Immunfluoreszenz und 3D DNA FISH ist, einerseits um das Epitop von dem Antikörper sowie die 3D-Architektur des Kerns detektiert erhalten und andererseits, damit das Eindringen der DNA-Sonde zu detektieren Genloci oder Chromosom Gebieten 1-5. Hier bieten wir ein Protokoll, das die Visualisierung von Chromatin Modifikationen mit genomischen Loci in 3D erhalten Kernen kombiniert.
Einleitung
Epigenetische Mechanismen auslösen Aufbau und Vererbung von Entwicklungs-und Zelltyp-spezifische Transkriptions-Profilen. Auf einer Ebene Dies beinhaltet Modulation der Chromatinstruktur Verpackungen, die aktive oder stille genomischen Regionen definiert. In einem größeren Maßstab, globale 3D Organisation des Genoms und Zellkernarchitektur spielen ebenfalls eine Rolle bei der Kontrolle der Transkriptions-Mustern. So ist Dissektion dieser epigenomischen wesentliche Merkmale für ein volles Verständnis, wie Gene 6-11 geregelt.
Kombiniert Immunfluoreszenz-und 3D-DNA FISH bieten eine einzigartige Möglichkeit, molekulare und biochemi....
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Protokoll
Ein. DNA Probe Labeling mit Fluorophoren: Nick Translation (~ 6 h)
- Saubere BAC DNA (hergestellt von Maxi-Prep) oder Plasmiden oder PCR-Produkte, die alle in H 2 O resuspendiert, kann für die Etikettierung verwendet werden. Beachten Sie, dass für eine robuste FISH Signal, Sonden sollten mindestens 10 kb überspannen.
- Inkubieren DNA in RNase A während 30 min bei 37 ° C (alle Reagenzien sind in Tabelle 1 aufgeführt).
- Inkubieren Sie die Nick-Translation Reaktion für 2 h bei 16 ° C (siehe Tabellen 2 und 3). Alternative Methoden der direkten Kennzeichnung verwendet werden (Beispiel:....
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Ergebnisse
DNA und Immuno-FISH sind im Laborbetrieb Skok um die Änderungen in Atom-Organisation mit dem Verfahren der V (D) J-Rekombination von Antigenrezeptors Loci während der B-und T-Lymphozyten-Entwicklung verbunden studieren. Die Techniken zuvor dargelegten uns ermöglichen, i) Messung Abstände zwischen den beiden Enden eines Locus (Kontraktion) ii) messen Abstände zwischen Allelen oder Loci (Paarung), iii) eine Analyse der DNA-Schädigung, die innerhalb Loci, iv) Bewertung der Standort der Allele und loci Bezug auf Atom-U-Fäch.......
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Diskussion
Die Techniken detailliert wurden oben in unserem Labor verwendet werden, um die Regulation der V (D) J-Rekombination der Immunglobulin und TCRA / d loci in Entwicklungsländern Lymphozyten 30,31 analysieren. Wir sind sicher, dass diese Technik für die Detektion verschiedener Kernproteinen, nukleare Abteile und Loci, in verschiedenen Zelltypen angepasst werden kann. Modifikationen des Protokolls notwendig sein kann, und in diesem Fall die Hauptschritte zu konzentrieren sind die folgenden. Erst.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir möchten die Mitglieder des Skok Labor, vor allem Susannah Hewitt, für Diskussionen und Kommentare. Diese Arbeit wird durch das National Institute of Health Zuschüsse R01GM086852, RC1CA145746 (JAS) unterstützt. JAS ist ein Leukemia & Lymphoma Society Gelehrter. JC ist ein Irvington Institute Fellow des Cancer Research Institute. MM wird von der National Science Foundation Grant Integrative Graduate Bildung und Forschung Traineeship (NSF IGERT 0.333.389) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenz / Material | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| H 2 O | Fischer | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397-C-11401 | |
| Cy3 oder Cy5 dUTP | Fischer | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0,025 um Filter | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1-DNA 1 mg / ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg / ml | Angewandte Genetik | # MHB | |
| Lachssperma | Sigma | # D1626 | Pulver bei 10 mg / ml in H 2 O resuspendiert werden |
| NaAc (Natriumacetat, pH 5,2, Puffer-Lösung) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fischer | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidon (Mol Biol grade) | Fischer | # BP431 | |
| Dextransulfat Pulver | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x-Lösung | Fischer | # BP1328 | |
| Formamid | Fischer | # BP227 | |
| Deckgläser | Fischer | # 12-548-B | |
| Slides | Fischer | # 12-550 | |
| 6-Well-Platten | Fischer | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fischer | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-Lysin-Lösung | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyd, Prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol Grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraktion V | Fischer | # BP 1600 | |
| Normalem Ziegenserum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol Grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x-Lösung | Fischer | # BP1325 | |
| ProLong Gold-antifade Reagenz | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Phenylindol) | Sigma | # D9542 | |
| Bester Test eine Schicht Gummi-Zement | Kunst oder Büromärkten | ||
| Tabelle 1. Spezifische Reagenzien und Kleingeräten. |
Referenzen
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
