Membraanpotentiaal Dye beeldvorming van ventromedial hypothalamus neuronen van volwassen muizen om te studeren Glucose Sensing
Summary
De activiteit van enige neuronen uit-volwassen leeftijd muizen kunnen worden bestudeerd door te distantiëren neuronen uit specifieke gebieden van de hersenen en het gebruik van fluorescerende membraanpotentiaal kleurstof beeldvorming. Door het testen respons op veranderingen in glucose, kan deze techniek worden gebruikt om de glucose gevoeligheid van volwassen ventromediale hypothalamus neuronen te bestuderen.
Abstract
Studies van neuronale activiteit worden vaak uitgevoerd met behulp van neuronen tegen knaagdieren minder dan 2 maanden als gevolg van de technische problemen in verband met het verhogen van het bindweefsel en een verminderde neuronale levensvatbaarheid die zich voordoen met de leeftijd. Hier beschrijven we een methode voor de dissociatie van gezonde neuronen van de hypothalamus van volwassen leeftijd muizen. De mogelijkheid om neuronen studie van volwassen leeftijd muizen maakt het gebruik van ziektemodellen die zich manifesteren op latere leeftijd en mogelijk meer ontwikkelingsgebied nauwkeuriger voor bepaalde onderzoeken. Fluorescentiebeelvorming van gedissocieerde neuronen worden gebruikt om de activiteit van een populatie van neuronen te bestuderen, in tegenstelling tot het gebruik elektrofysiologie een neuron bestuderen. Dit is bijzonder nuttig bij het bestuderen van een heterogene neuronale populatie waarbij het gewenste neuronale type is zeldzaam zoals hypothalamus glucose sensing neuronen. We gebruik gemaakt van membraanpotentiaal kleurstof beeldvorming van volwassen ventromedial hypothalamus neuronen om hun reacties te bestuderen om change's in extracellulaire glucose. Glucose sensing neuronen worden verondersteld een rol te spelen bij centrale regulatie van de energiebalans. Het vermogen om glucose sensing studie bij volwassen knaagdieren is bijzonder nuttig omdat het overwicht van aandoeningen gerelateerd aan disfunctioneel energiebalans (bijv.. Obesitas) toe met de leeftijd.
Introduction
De hersenen reguleert energie homeostase door de neuro-endocriene en autonome zenuwstelsel. De ventromediale hypothalamus (VMH), bestaande uit de ventromediale kern (VMN) en de boogvormige nucleus (ARC), is belangrijk voor de centrale regulatie van energie homeostase. Gespecialiseerde glucose sensing neuronen, in de VMH, koppelen neuronale activiteit en perifere glucose-homeostase 1. Er zijn twee soorten glucose sensing neuronen, glucose opgewekt (GE) neuronen verhogen en glucose geremd (GI) neuronen verminderen hun activiteit extracellulair glucose toeneemt. VMH glucose sensing neuronen algemeen bestudeerd middels elektrofysiologie of calcium / membraanpotentiaal kleurstof beeldvorming.
De elektrofysiologische patch clamp techniek wordt beschouwd als de gouden standaard in de studie van ex vivo neuronale activiteit. In deze techniek wordt een glazen micropipet elektrode naar de celmembraan via een grote weerstand gekoppeld(GQ) afdichting. Patch clamp elektroden mogelijk real time opname van actiepotentiaal frequentie (stroomtang) of ion geleidbaarheid (voltage clamp) verandert binnen een enkel neuron. Terwijl de patch-clamp techniek geeft informatie over veranderingen in specifieke ionkanaal geleidingen, een groot nadeel is dat slechts een neuron waargenomen tegelijk. Het duurt ongeveer 30-45 minuten van de opname te controleren of men opneemt van een glucose-sensing neuron voordat zelfs het begin van een bepaalde experimentele behandeling. Bovendien GI en GE neuronen omvatten <20% van de totale VMH neuronale populatie. Compounding dit probleem is het gebrek in veel gevallen, een identificatie cellulaire marker voor deze neuronen. Het is dus duidelijk dat ondanks waardevolle elektrische informatie die andere technieken niet patch clamp analyse bewerkelijk, tijdrovend en lage opbrengst.
Het gebruik van fluorescentie beeldvorming van gedissocieerde VMH neuronen maakt de studie van hundreds neuronen tegelijk. Calcium gevoelige kleurstoffen kunnen worden gebruikt om intracellulair calcium veranderingen, die indirect correleren met veranderingen in neuronale activiteit te meten. Membraanpotentiaal gevoelige kleurstoffen worden gebruikt om membraanpotentiaal veranderingen te monitoren. Meten cellulaire membraanpotentiaal een directere index van neuronale activiteit vergeleken met veranderingen in intracellulaire calcium. Bovendien membraanpotentiaal kleurstof (MPD) beeldvorming detecteert potentieel kleinere veranderingen in membraanpotentiaal waar actiepotentiaal afvuren niet wordt gewijzigd en intracellulair calcium niveaus zou niet kunnen veranderen. Beide fluorescentie beeldvorming technieken gebruikt om VMH glucose sensing neuronen bestuderen van jonge muizen 2-7. Terwijl de resultaten minder gedetailleerd dan die verkregen met patch clamp elektrofysiologie, de sterkte van beeldvormende experimenten is dat ze gelijktijdig evalueren van een grote populatie van cellen die onvermijdelijk zijn een groot aantal glucose sensing neuronen. MPD beeldvorming iis vooral handig voor het bestuderen van GI neuronen die meer uniform gelokaliseerd in het hele VMH zijn, dus een adequaat bevolking om te studeren in de gedissocieerde VMH (~ 15% GI). Daarentegen, terwijl GE neuronen dicht zijn gelokaliseerd in het ventrolaterale-VMN en mobiele arm gebied tussen de ARC en VMN, zij geen aanzienlijk aantal neuronen in de VMH (<1% GE) vertegenwoordigen. Bovendien, door het bestuderen van geïsoleerde neuronen, astrocyten en presynaptische effecten worden geëlimineerd. Dit kan een voordeel bestuderen eerste orde neuron effecten, evenals een nadeel omdat fysiologische verbindingen en processen verloren.
Een beperkende factor in zowel patch clamp elektrofysiologie en MPD / calcium kleurstof beeldvorming de noodzaak jongere dieren (bijv.. Muizen of ratten <8 weken oud) gebruikt. Dit is voornamelijk te wijten aan toegenomen bindweefsel in combinatie met verminderde neuronale levensvatbaarheid die optreedt met de leeftijd. In brain-slice elektrofysiologie studven, verhoogd bindweefsel maakt het moeilijker om de neuronen te visualiseren. Verhoogde bindweefsel maakt het ook moeilijker om een groot aantal gezonde neuronen dissociëren voor imaging studies. Bovendien neuronen van jongere dieren langer overleven tijdens ofwel patch clamp opnamen of beeldvorming. Echter, het gebruik van jonge muizen een belangrijke beperking zijn. Neuronale activiteit en / of reacties op neurotransmitters of voorkwam nutriënten veroudering veranderen. Bijvoorbeeld, omdat energiebalans nauw verbonden is met de reproductieve status van de hypothalamus neuronen reguleren energiebalans kunnen anders reageren in de pre-vs postpubescent dieren. Bovendien zijn veel ziekten vereisen een langdurige behandeling of niet manifesteren tot volwassenheid. Prime voorbeelden van dergelijke ziekten zijn dieet obesitas of diabetes mellitus type 2. Aangezien glucose sensing neuronen worden verondersteld een rol te spelen bij deze ziekten hebben we een methode voor het succesvol kweken van gezonde volwassen VMH neuronen voor gebruik in MPD beeldvorming experiments.
Protocol
Representative Results
Discussion
De sleutel tot de mogelijkheid om de activiteit van neuronen bestuderen van volwassen muizen is de mogelijkheid om gezonde neuronen dissociëren. Dissociatie van de hypothalamus neuronen van volwassen muizen is moeilijker bij een aantal belangrijke stappen in het protocol vergeleken met neuronen van juveniele muizen. We hebben dit probleem op een aantal manieren. Maken dikke 500 urn hersenenplakken minimaliseert mechanische beschadiging van neuronen ten opzichte van de gebruikelijke 250-350 urn plakjes voor hersenweefse…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
Referenzen
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?. Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
- Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
- Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
- Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
- Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
- Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).
- Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
- Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).
