ממברנה דיי הדמיה אפשרית של ventromedial היפותלמוס נוירונים מעכברים בוגרים ללמוד גלוקוז חישה
Summary
פעילותם של נוירונים בודדים מעכברים בגיל מבוגרים ניתן ללמוד על ידי מתנער נוירונים מאזורים מסוימים במוח ובאמצעות הדמיה לצבוע פוטנציאל הממברנה ניאון. על ידי תגובות בדיקות לשינויים ברמת סוכר, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את רגישות הגלוקוז של נוירונים ההיפותלמוס ventromedial מבוגרים.
Abstract
מחקרים של פעילות עצבית לעתים קרובות מבוצעים באמצעות נוירונים ממכרסמים פחות מ -2 חודשים של גיל בשל הקשיים הטכניים הקשורים לרקמת חיבור גוברת וירידה בכדאיות עצבית המתרחשות עם גיל. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לניתוק של נוירונים ההיפותלמוס בריאים מעכברים בגיל מבוגר. היכולת ללמוד נוירונים מעכברים בוגרים בגיל מאפשרת שימוש במודלי מחלה המתבטא בגיל מאוחר יותר והוא עשוי להיות יותר מבחינה התפתחותית מדויק ללימודים מסוימים. דימות פלואורסצנטי של נוירונים ניתקו יכולה לשמש כדי לחקור את הפעילות של אוכלוסייה של נוירונים, בניגוד לשימוש באלקטרופיזיולוגיה ללמוד נוירון בודד. התכונה זו שימושית במיוחד כאשר לומד אוכלוסייה עצבית הטרוגניות שבהן הסוג העצבי הרצוי הוא נדיר כגון לתאי עצב גלוקוז חישת ההיפותלמוס. אנו מנוצלים הדמיה לצבוע פוטנציאל הממברנה של נוירונים ההיפותלמוס ventromedial מבוגרים ללמוד את התגובות שלהם לצ'הnges ברמת הגלוקוז החוץ תאי. הם האמינו נוירונים חישת הגלוקוז לשחק תפקיד בויסות מאזן אנרגיה מרכזית. היכולת ללמוד חישת הגלוקוז במכרסמים מבוגרים היא שימושית במיוחד מאז דומיננטיות של מחלות הקשורות לאיזון מתפקד אנרגיה (למשל. השמנת יתר) עם עלייה בגיל.
Introduction
המוח מווסת הומאוסטזיס אנרגיה באמצעות נוירואנדוקריניים ומערכת עצבים אוטונומית. ההיפותלמוס ventromedial (VMH), מורכב מגרעין ventromedial (VMN) וגרעין מקושת (ARC), הוא חשוב לרגולציה של הומאוסטזיס אנרגיה המרכזית. נוירונים חישת הגלוקוז מיוחדים, בתוך VMH, לקשר פעילות עצבית והומאוסטזיס הגלוקוז פריפרית 1. ישנם שני סוגים של גלוקוז חישת תאי עצב; גלוקוז נרגשים (GE) נוירונים להגדיל בעוד גלוקוז עכבות הנוירונים (GI) להקטין את פעילותם עם עלייה ברמת סוכר תאית. נוירונים גלוקוז VMH חישה בדרך כלל למדו באמצעות אלקטרופיזיולוגיה או הדמיה צבע סיד / קרום פוטנציאלי רגישה.
טכניקת מהדק תיקון אלקטרו נחשבת סטנדרטי במחקר של vivo לשעבר פעילות עצבית זהב. בטכניקה זו, אלקטרודה micropipette זכוכית מחוברת לממברנת התא באמצעות עמידות גבוההחותם (GΩ). אלקטרודות מהדק תיקון מאפשרות הקלטה בזמן אמת של תדר פוטנציאל פעולה (מהדק הנוכחי) או מוליכות יון (מהדק מתח) שינויים בתוך תא עצב יחיד. בעוד טכניקת מהדק התיקון מספקת מידע מפורט בנוגע לשינויים בconductances ערוץ יון מסוים, חסרון עיקרי הוא שרק אחד הנוירון עלול נצפה בכל פעם. זה לוקח בערך 30-45 דקות של הקלטה כדי לוודא שאחד הוא הקלטה מתא עצב חישת הגלוקוז, עוד לפני שמתחיל טיפול ניסיוני ספציפי. יתר על כן, תאי עצב במערכת העיכול ומהווים GE <20% מכלל האוכלוסייה העצבית VMH. הרכבה את הבעיה היא חוסר, במקרים רבים, של סמן סלולארי זיהוי לנוירונים אלה. לפיכך, ברור כי למרות מתן מידע בעל ערך חשמלי שטכניקות אחרות לא יכולים, ניתוח מהדק תיקון הוא מייגע, זמן רב ותשואה נמוכה.
השימוש בדימות פלואורסצנטי של תאי עצב VMH ניתקו מאפשרת לחקר hundreds של נוירונים בו זמנית. צבעים רגישים סידן ניתן להשתמש כדי למדוד שינויי סידן תוך תאי, אשר בעקיפין לתאם לשינויים בפעילות עצבית. צבעים רגישים פוטנציאל הממברנה משמשים לניטור שינויי פוטנציאל הממברנה. מדידת פוטנציאל הממברנה תאית היא מדד ישיר יותר של פעילות עצבית בהשוואה לשינויים ברמות סידן תוך תאי. יתר על כן, הדמיה קרום פוטנציאל צבע (MPD) שעלול להיות מזהה שינויים קטנים יותר בפוטנציאל הממברנה שבו ירי פוטנציאל פעולה לא משתנים ורמות סידן תוך תאי לא יכולות לשנות. שתי טכניקות ההדמיה הקרינה אלה נעשו שימוש כדי לחקור תאי עצב חישת הגלוקוז VMH מעכברים לנוער 2-7. אמנם תוצאות הן פחות מפורטות מאלו שהושגו עם אלקטרופיזיולוגיה מהדק תיקון, כוחו של ניסויי הדמיה הוא שהם בו זמנית להעריך אוכלוסייה גדולה של תאים שבהכרח כוללים מספר משמעותי של תאי עצב חישת הגלוקוז. i ההדמיה MPDזה שימושי במיוחד לחקר תאי עצב במערכת העיכול שהם יותר אחיד מקומיים לאורך כל VMH; וכך לספק אוכלוסייה מתאימה ללמוד בVMH ניתק (~ GI 15%). בניגוד לכך, בעוד שנוירונים GE בצפיפות מקומיים לventrolateral-VMN ותא באזור בין עניי ARC וVMN, הם לא מייצגים את מספר משמעותי של תאי עצב בתוך VMH (<1% GE). יתר על כן, על ידי לימוד נוירונים בודדים, astrocytic ואפקטי presynaptic בוטלו. זה יכול להיות יתרון בחקר ההשפעות של נוירון הצו ראשון, כמו גם חסרון שכן קשרים ותהליכים פיסיולוגיים הולכים לאיבוד.
גורם מגביל בשני אלקטרופיזיולוגיה מהדק התיקון והדמיה לצבוע MPD / סידן הוא הצורך בשימוש בבעלי חיים צעירים (למשל. עכברים או חולדות <8 שבועות של גיל). זה בעיקר בשל רקמת חיבור מוגברת בשילוב עם ירידת כדאיות עצבית המתרחשת עם גיל. בהרבעת אלקטרופיזיולוגיה מוח פרוסהies, רקמת חיבור מוגברת עושה את זה יותר קשה לדמיין את תאי העצב. רקמת חיבור גדל גם עושה את זה יותר קשה לנתק מספר גדול של תאי עצב בריאים לבדיקות הדמיה. יתר על כן, נוירונים מבעלי חיים צעירים לשרוד זמן רב יותר בזמן או הקלטת מהדק תיקון או הדמיה. עם זאת, השימוש בעכברים צעירים יכול להיות מגבלה העיקרית. פעילות ו / או תגובות לשליחים עצביים או חומרים מזינים במחזור עצבי משתנות עם גיל. לדוגמא, מאז מאזן אנרגיה קשור באופן הדוק למצב פוריות, נוירונים ההיפותלמוס ויסות מאזן אנרגיה עשויים להגיב באופן שונה ב- vs מראש חיות postpubescent. בנוסף, מחלות רבות דורשות טיפול לטווח ארוך או לא להתבטא עד לבגרות. דוגמאות מובהקות של מחלות כאלה הן השמנה או סוכרת מסוג 2 סוכרת תזונתית. מאז הם האמינו נוירונים חישת הגלוקוז לשחק תפקיד במחלות אלה פיתחנו מתודולוגיה לculturing הצלחת נוירונים VMH בוגר בריאים לשימוש בexp ההדמיה MPDeriments.
Protocol
Representative Results
Discussion
המפתח ליכולת ללמוד פעילות של נוירונים מעכברים בוגרים הוא היכולת לנתק את תאי העצב בריאים. דיסוציאציה של נוירונים ההיפותלמוס מעכברים בוגרים קשה יותר בכמה שלבים עיקריים בפרוטוקול בהשוואה לנוירונים מעכברים לנוער. יש לנו להתגבר על בעיה זו במספר הדרכים. מה שהופך את פרוסו…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
Referenzen
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?. Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
- Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
- Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
- Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
- Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
- Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).
- Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
- Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).
