グルコース感知を勉強する成体マウス由来の膜視床下部腹内側部のニューロンの電位色素イメージング
Summary
成人老化マウスからの単一ニューロンの活性は、特定の脳領域のニューロンを解離し、蛍光膜電位色素イメージングを用いて研究することができる。グルコースの変化に対する応答を試験することによって、この手法は、成体腹内側視床下部ニューロンのグルコース感受性を研究するために使用することができる。
Abstract
神経活動の研究はしばしば増加結合組織に関連する技術的な問題へのげっ歯類歳未満2ヶ月から神経細胞を使用して実行し、年齢とともに起こる神経細胞の生存率を減少している。ここでは、成人老齢マウスから健康的な視床下部ニューロンの解離のための方法論を説明します。成人老齢マウスからニューロンを研究する能力は、後の年齢で現れる疾患モデルを使用することができ、より正確な発生的に、特定の研究のためかもしれません。単一ニューロンを研究するために電気を使用するのではなく、解離したニューロンの蛍光撮像は、ニューロンの集団の活性を研究するために使用することができる。希望の神経細胞のタイプは、視床下部グルコース感知ニューロンの希である異種のニューロン集団を研究するときに特に便利です。私たちは、茶への回答を研究する大人の腹内側視床下部ニューロンの膜電位色素イメージングを利用細胞外のグルコースのnges。グルコース感知ニューロンは、エネルギーバランスの調節において中心的な役割を果たしていると考えられている。大人のげっ歯類でグルコース感知を研究する能力は機能不全のエネルギーバランスに関連する疾患の優位ので、特に有用である（ 例えば 。肥満）年齢とともに増加。
Introduction
脳は神経内分泌および自律神経系を通じてエネルギー恒常性を調節する。視床下部腹内側部（VMH）は、腹内側核（VMN）と弓状核（ARC）で構成され、エネルギー恒常性の中央制御に重要である。専門的なグルコース感知ニューロンは、VMH内で、神経活動と周辺グルコース恒常1をリンクします。励起されたグルコース（GE）グルコース（GI）ニューロンは、細胞外グルコースが増加するにつれて、それらの活性を低下させる阻害したニューロンが増加;ニューロンを感知するグルコースの2種類がある。 VMHのグルコース感知ニューロンは、一般的に電気生理学またはカルシウム/膜電位感受性色素イメージングを用いて研究している。
電気生理学的パッチクランプ法は、ex vivoで神経活動の研究にゴールドスタンダードであると考えられている。この技術では、ガラスマイクロピペット電極は、高抵抗を介して細胞膜に結合している（GΩ）シール。パッチクランプ電極は、活動電位の周波数（電流クランプ）をリアルタイムで記録またはイオンコンダクタンス（電圧クランプ）は、単一のニューロン内での変更を可能にする。パッチクランプ法は、特定のイオンチャネルコンダクタンスの変化に関する詳細な情報を提供するが、主な欠点は、1つのニューロンが同時に観察され得ることである。それも、具体的な実験的治療を開始する前に、グルコース感知ニューロンからその1が記録されていることを確認するために記録の約30〜45分かかります。また、GI及びGEニューロンは<総VMHニューロン集団の20％を含む。この問題を配合すると、これらのニューロンの識別の細胞マーカーの多くの場合、不足です。従って、明らかである他の技術は、パッチクランプ分析は面倒であることができない貴重な電気的情報、時間がかかり、低い収率を与えるにもかかわらず。
解離VMHニューロンの蛍光イメージングの使用は、HUの研究を可能にする同時にニューロンのndreds。カルシウム感受性色素は、間接的に神経活動の変化に相関する細胞内カルシウムの変化を測定するために使用することができる。膜電位感受性色素、膜電位の変化をモニターするために使用される。細胞膜電位を測定することは、細胞内カルシウムレベルの変化と比較して、ニューロンの活動のより直接的な指標である。さらに、膜電位色素（MPD）イメージングは、潜在的に活動電位発火が変更されておらず、細胞内カルシウムレベルは変化しない可能性があり、膜電位の小さい変化を検出する。これらの蛍光イメージング技術の両方が、幼若マウス2-7からVMHグルコース感知ニューロンを研究するために使用されてきた。結果は、パッチクランプ電気生理学を用いて得られたものよりも詳細であるが、イメージング実験の強度は、それらが同時に必然的にグルコース感知ニューロンの有意な数を含む細胞の大きな集団を評価することである。 MPDイメージングIより均一に全体VMH全体局在している消化管の神経細胞を研究するために特に有用だ、したがって解離しVMH（〜15％GI）で勉強するための十分な集団を提供する。 GEのニューロンが密腹-VMNとARCとVMN間のセルが悪い領域に局在している間は対照的に、彼らはVMH内のニューロン（<1％、GE）のかなりの数を表すものではありません。さらに、単離された神経細胞を研究することによって、星状細胞とシナプス前効果が除去される。生理的接続およびプロセスが失われるので、これは一次ニューロン効果を研究する利点、ならびに不利であることができる。
パッチクランプ電気生理学およびMPD /カルシウム色素イメージングの両方を制限する要因は、若い動物（ 例えば 。マウスやラット<8週齢）を使用する必要がある。これは、加齢に伴って起こる減少し、神経細胞の生存能力と組み合わせて、増加した結合組織に主にある。脳スライスの電気生理学スタッド中新設、結合組織の増加は、それがより困難にニューロンを可視化することができる。増大した結合組織はまた、硬いイメージング研究のための健康なニューロンの大多数を解離することができる。さらに、若い動物からのニューロンは、パッチクランプ記録や撮影のいずれかの間長く生き残る。しかし、若いマウスの使用が主な制限することができます。神経活動および/または神経伝達物質または循環の栄養素に対する応答は、年齢とともに変化する。エネルギーバランスは密接生殖状態に固定されているので、たとえば、エネルギーバランスを調節する視床下部ニューロンは、事前VS思春期後の動物で異なる反応を示すことがある。さらに、多くの疾患は、長期治療を必要とするか、または成人期まで現れていない。このような疾患の主な例は、食事性肥満や2型糖尿病である。グルコース感知ニューロンは、これらの疾患において役割を果たしていると考えられているので、我々が正常MPD撮像expのに使用するために、健康な成人VMHニューロンを培養するための方法論を開発eriments。
Protocol
Representative Results
Discussion
成体マウスの神経細胞の活動を研究することができることへの鍵は、健康的な神経細胞を解離させる能力である。成体マウスの視床下部ニューロンの解離は幼若マウス由来のニューロンと比較して、プロトコルのいくつかの重要なステップでより困難である。我々は、多くの方法でこの問題を克服している。厚手の500ミクロンの脳スライスを作ることは、若いマウスからの脳組織のために使?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIHのR01 DK55619、NIHのR21をCA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
Referenzen
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