Utilisation de co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique

Summary

Les bactéries produisent des composés sécrétés qui ont le potentiel d'affecter la physiologie de leurs voisins microbiennes. Nous décrivons ici un écran de co-culture qui permet la détection de ces médiation chimiquement interspécifiques interactions en mélangeant les microbes du sol avec des souches rapporteurs fluorescents transcription de Bacillus subtilis sur milieu solide.

Abstract

Dans la nature, les bactéries existent rarement dans l'isolement, ils sont plutôt entourés d'un large éventail d'autres micro-organismes qui modifient l'environnement local en sécrétant des métabolites. Ces métabolites ont le potentiel de moduler la physiologie et la différenciation de leurs voisins et microbiennes sont des facteurs susceptibles importants dans la création et le maintien de communautés microbiennes complexes. Nous avons développé un écran de co-culture à base de fluorescence pour identifier ces interactions microbiennes médiées par voie chimique. L'écran consiste à combiner une souche rapporteur de transcription fluorescent avec des microbes de l'environnement sur milieux solides et en permettant aux colonies de se développer en co-culture. Le rapporteur transcriptionnel fluorescent est conçu de telle sorte que la souche bactérienne choisie est fluorescent lorsqu'il exprime un phénotype particulier d'intérêt (à savoir la formation de biofilms, la sporulation, la production de facteurs de virulence, etc.) Le criblage est réalisée dans des conditions de croissance WHEre ce phénotype n'est pas exprimé (et donc de la souche rapporteuse est typiquement non-fluorescent). Quand un microbe environnement sécrète un métabolite qui active ce phénotype, il diffuse à travers l'agar-agar et active la construction de rapporteur fluorescent. Cela permet au-métabolite produisant induire microbe devant être détectée: ce sont les colonies non fluorescentes plus proximales des colonies fluorescentes. Ainsi, cet écran permet l'identification des microbes de l'environnement qui produisent des métabolites diffusibles qui activent une réponse physiologique particulier dans une souche de journaliste. Cette publication explique comment: a) sélectionner des conditions de dépistage de co-culture appropriées, b) préparer le journaliste et les microbes de l'environnement pour le dépistage, c) effectuer l'écran de co-culture, d) isoler putatif organismes induisant, et e) de confirmer leur activité dans un écran secondaire. Nous avons développé cette méthode pour dépister les organismes du sol qui activent biofilm matrice-production dans Bacillus subtilis </em>, mais nous discutons aussi de considérations pour l'application de cette approche à d'autres bactéries génétiquement dociles.

Introduction

Nous sommes intéressés à comprendre comment les métabolites que les bactéries sécrètent affectent la physiologie et le développement des microbes voisins. De nombreux métabolites ont été caractérisés pour leurs effets bioactifs sur d'autres microbes. Deux exemples bien décrits comprennent les antibiotiques, qui inhibent la croissance d'autres micro-organismes et des molécules de détection de quorum, qui altèrent l'expression génique globale d'autres microbes. Cependant, les bactéries produisent de nombreuses autres petites molécules de produits naturels qui n'ont pas de bioactivité connus ^1. Nous émettons l'hypothèse que les bactéries ont évolué et conservé la capacité de produire certains de ces métabolites car ils leur permettent de moduler la physiologie cellulaire de leurs voisins microbiennes dans les communautés microbiennes complexes qui existent dans la plupart des bactéries.

Les types de cellules de Bacillus subtilis

Nous avons concentré nos études sur les interactions microbiennes médiation chimique qui impliquent Bacilsubtilis UGB. Ce n'est pas seulement en raison de son statut de bactérie modèle à Gram positif et les outils génétiques résultantes disponibles pour sa manipulation, mais aussi en raison de sa capacité à se différencier en différents types cellulaires caractérisés. Des exemples comprennent des cellules qui sont: la natation, produisant la matrice extracellulaire qui est requise pour la formation de biofilm robuste; compétentes pour absorber l'ADN à partir de l'environnement, et la sporulation, entre autres ^deux. Chacun de ces types de cellules exprime un régulon de transcription caractéristique qui les rend physiologiquement et / ou physiquement distinct de leurs frères et sœurs génétiquement identiques. Dans de nombreuses conditions de croissance, plusieurs types de cellules coexistent en tant que sous-populations différentes au sein d'une seule colonie de B. cellules subtilis ^3. Bien que de nombreuses espèces de bactéries peuvent présenter analogue type de cellule hétérogénéité, ce phénomène a été particulièrement bien étudié dans B. subtilis.

En particulier, les gènes qui sont epuegulated à l'intérieur de chacun de ceux-ci spécifique B. types de cellules subtilis ont été identifiés. L'identification de ces gènes régulés à la hausse est essentiel pour le travail décrit ici parce que beaucoup de ces phénotypes microbiennes d'intérêt sont difficiles ou impossibles à observer directement. Par exemple, nous ne pouvons pas détecter visuellement un trait comme la natation sur de solides (1,5%) des plaques d'agar, même si une sous-population de B. cellules subtilis produisent des flagelles dans ces conditions ^3. Un autre exemple est biofilm matrice-production. la production de la matrice peut être visualisée par la morphologie des colonies (comme il en résulte colonies ridées macroscopiquement), mais seulement sur ​​certains milieu de culture, et seulement après plusieurs jours de croissance ^4. Cependant, en connaissant les gènes qui sont régulés à la hausse au cours de la différenciation, on peut construire reporters transcriptionnels qui agissent comme des marqueurs de différenciation cellulaire dans ces types cellulaires.

constructions Reporter

Ces fluorescent transcriptional reporters sont constitués par les promoteurs pour des gènes spécifiques du type cellulaire entraînant la production d'un gène rapporteur, par exemple une protéine fluorescente. Les exemples incluent P _hag-YFP (pour la natation cellules), P _Tapa-YFP (pour les cellules de la matrice produisant biofilm), et P _SSPB-YFP (pour la sporulation des cellules), où P _x indique la région du promoteur pour le gène x. Ces constructions rapporteurs sont intégrés dans un locus sur le chromosome neutre (figure 1 et le voir ci-dessous) de sorte que la régulation native du phénotype est laissée intacte. Cependant, maintenant, quand une cellule exprime ce phénotype, il exprime aussi une protéine fluorescente. Ceci permet d'obtenir une lecture facile à visualiser de l'activation du comportement particulier phénotypique, ce qui nous permet de cribler des microbes qui activent cette réponse physiologique. Bien que de tels rapporteurs sont couramment utilisés en microbiologie, ils n'ont pas été largement appliquée dans des écrans à identifinteractions métaboliques entre les microbes y avant cette méthode a été décrite ^5.

Il ya un certain nombre de considérations importantes dans la conception et la construction de-spécifique de type cellules souches rapporteurs. Nous avons utilisé journalistes fluorescents exclusivement transcription, bien que d'autres types de constructions sont certainement possibles. Nous déconseillons l'utilisation de fusions traductionnelles comme marqueurs de différenciation de type de cellule dans l'écran, cependant, pour deux raisons: 1) le désir de quitter le spécifique de type cellulaire protéine native imperturbable, et 2) la reconnaissance que diffuse, cellulaire large fluorescence sera plus facile à détecter que les points lacrymaux localisée dans les cellules (commun avec fusions traductionnelles).

sélection d'un gène rapporteur

Après avoir décidé d'utiliser la transcription en-lue, le gène rapporteur doit être sélectionnée (par exemple LacZ, fluorescence, ou la luciférase). LacZ a l'avantage de nécessiter le moins spécialeized matériel de détection, mais il ya un risque beaucoup plus élevé de faux positifs parmi les microbes de l'environnement. Dans nos mains, le niveau du lac organismes ⁺ parmi les microbes du sol de fond était prohibitif (>> 10% des microbes du sol étaient bleues (Lac ⁺⁾ sur des plaques X-gal; données non présentées). Il est possible que la concentration en titrant de X-gal dans le milieu, ce qui pourrait être optimisé pour permettre l'utilisation d'un rapporteur X-gal, mais nous n'avons pas cherché ce produit. Luciférase offre une grande sensibilité de détection et est le journaliste le plus orthogonal: il n'y a presque aucune chance de microbes de l'environnement étant intrinsèquement luminescent. Cependant, nous avons constaté qu'il est difficile d'identifier les instruments à notre institution qui permettait la détection de luminescence dans des boîtes de Pétri entières, comme la plupart ont été conçus pour numériser les régions ne localisées dans des plaques multi-puits. Il pourrait également y avoir des complications dans la visualisation des colonies luminescents d'une manière qui a également permis à la physique simultanée estolation des organismes induisant. Tout en utilisant des fiduciaires peut avoir rendu cela possible, nous la place choisi d'utiliser journalistes transcription fluorescentes, qui ont été prouvée à travailler en B. subtilis, à condition sensibilité adéquate des taux de détection et de faux positifs faibles entre les organismes du sol, et autorisés à utiliser des instruments facilement disponibles à la fois pour la visualisation et les procédures d'isolement.

sélection de fluorophore

Le fluorophore spécifique choisi dépendra de vos espèces bactériennes, le milieu de croissance agar que vous utilisez, et le filtre de fluorescence particulier définit dont vous disposez. Avec nos instruments, nous avons constaté que les deux B. subtilis eux-mêmes et l'agar ils ont été cultivés sur exposé moins de fluorescence de fond quand YFP (protéine fluorescente jaune) filtres ont été utilisés, ce qui rend ce journaliste supérieure à la GFP (protéine fluorescente verte) dans nos mains colonies. L'usage des codons des protéines fluorescentes sontsouvent optimisé pour les eucaryotes, il est donc important de choisir un fluorophore soit connu de la littérature de travailler dans vos espèces bactériennes, ou pour tester explicitement l'aide d'un promoteur constitutif. Un grand nombre de constante évolution variantes de protéines fluorescentes sont actuellement disponibles ^6, qui ont été examinés dans un certain nombre de sources ^7,8, dont certains prévoient explicitement des conseils sur le choix d'une protéine fluorescente correspondant à votre expérience ^9.

sélection de promoteur

La sélection d'un promoteur dépendra en grande partie sur le type de cellule ou phénotype d'intérêt. Pour les organismes tels que B. subtilis, certains gènes rapporteurs spécifiques du type cellulaire ont été établies dans la littérature. Pour d'autres souches bactériennes, en examinant microarray ou données transcription sera nécessaire de fournir des informations sur les gènes qui sont fortement régulés à la hausse dans les conditions où votre intérêt i cellulaires manifesté. Une étude récente a catalogué la transcription de B. subtilis moins de 104 différentes conditions de croissance à l'aide de puces à ADN de carrelage ^10. Ce document fournit des informations complètes sur les gènes sont fortement régulés à la hausse dans des conditions différentes, ce qui est inestimable pour les phénotypes moins bien caractérisés.

Plutôt que de cartographier les régions promotrices précises pour chaque gène d'intérêt, nous utilisons généralement tout simplement la séquence 200-500 pb en amont du gène en tant que promoteur. La longueur de la séquence exacte dépend du contexte génomique: les régions plus courtes sont utilisés lorsque cela est nécessaire pour éviter d'inclure des régions codantes en amont du cadre de lecture ouvert voisin.

Loci et l'intégration neutre

Comment maintenir la construction reporter dans votre souche bactérienne devient la dernière question de la conception d'une souche de transcription rapporteur fluorescent. Chez les bactéries, les gènes d'intérêt sont souvent maintenussur des plasmides à l'aide de la sélection antibiotique. Cependant, il peut ne pas être possible d'utiliser des antibiotiques au cours de la co-culture sans tuer les microbes environnementaux. Si plasmides sont maintenus de façon stable dans vos espèces bactériennes, il peut être possible cultiver vos bactéries contenant un journaliste porté par un plasmide en présence d'antibiotiques pour préparer votre rapporteur pour le dépistage, puis éliminer les antibiotiques au cours de la co-culture elle-même dans l'espoir que le plasmide être maintenue suffisamment pour permettre la fluorescence. Toutefois, si les plasmides sont facilement perdus dans votre bactérie, ou sont perdus dans des conditions de stress, ce ne sera pas une option viable. Dans de nombreux cas, la meilleure solution consiste à intégrer la construction de rapporteur sur le chromosome bactérien, ce qui permet le maintien stable du rapporteur, même en l'absence de sélection. Pour l'intégration de ne pas perturber l'expression normale ou d'un règlement de votre gène d'intérêt, nous vous recommandons d'intégrer dans un site ectopique sur le chromosome que can agir comme un «lieu neutre». Dans B. subtilis ces sites d'intégration sont des gènes qui – lorsqu'ils sont mutés – transmettre un phénotype dans certains médias minimale (permettant intégrants à être identifiés sans sélection antibiotique), mais ne modifient pas la croissance ou le taux de sporulation dans les médias riches, et inclure ces gènes que amyE, lacA, thrC, pyrD, GLTA, et Saca (transport de la capacité à utiliser l'amidon, β-galactosides, la thréonine, l'uracile, le glutamate et le saccharose, respectivement) ^11-13.

Bien que l'intégration de ces gènes ont été utilisés de manière fiable pendant de nombreuses années à B. subtilis (en particulier au amyE et lacA), la même connaissance peut ne pas être disponible pour des gènes dans de nombreuses autres espèces bactériennes. L'utilisation de sites de fixation du phage sont une bonne alternative pour les sites d'intégration chromosomiques neutres: de nombreuses spécifiques à l'espèce ^{14 à 16,} ainsi que les sites d'intégration généraux, tels que le site de fixation de Tn7 (att) ont Tn7été identifié et utilisé pour les insertions de gènes chez de nombreuses espèces bactériennes ^17,18.

Microbes de l'environnement

Nous utilisons le sol comme une source directe des microbes de l'environnement pour l'écran de co-culture. Le sol contient une grande diversité de microbes, et bon nombre de ces organismes sont riche source de produits naturels. En utilisant des suspensions liquides de sol placés directement sur des plaques avec notre souche rapporteur transcriptionnel fluorescente (sans isolement préalable des bactéries du sol), nous simplifions grandement l'approche expérimentale. Le sol peut être utilisé soit immédiatement après la récolte, ou être congelé à -80 ° C pour une utilisation future. Utilisation immédiate a l'avantage une plus grande diversité de microbes peut potentiellement être cultivé, y compris ceux qui ne survivra pas bien la congélation. Il présente l'inconvénient que la concentration des organismes du sol cultivable partir de ces échantillons est inconnue, ce qui augmente le nombre de plaques d'écran qui doit être utilisé. Delayed utilisation présente l'avantage que les cfu / ml pour chaque source dans le sol peuvent être déterminés à l'avance, ce qui permet un certain nombre de colonies optimisé pour être cultivée sur chaque plaque d'écran. Cependant, elle nécessite que les organismes du sol soient capables de survivre à la congélation.

Notez que la diversification de la piscine de l'inducteur en cours d'examen (c'est à dire les sources de sol) semble être plus efficace dans l'identification de nouveaux interspécifiques interactions que le dépistage en profondeur sur le même sol: une plus grande diversité phylogénétique a été observée dans les résultats identifiés dans notre écran matrice induction sources de sol supplémentaires ont été examinées plutôt que le dépistage des mêmes sources plus approfondie du sol (EA queue et R. Kolter, Harvard Medical School, résultats non publiés).

Vue d'ensemble

L'approche que nous décrivons ici est simple en termes de ses exigences techniques. Il s'agit de: 1) la construction d'une transcription rapporteur fluorescent dans B. subtilis ou uned'autres espèces bactériennes d'intérêt, 2) l'identification des conditions dans lesquelles cette rapporteur n'est pas activé, 3) la préparation d'aliquotes de cette souche rapporteuse et les organismes à cribler (dans notre sol de cas, mais d'autres sources peuvent être utilisées à la place), 4) le mélange de ceux-ci deux ensembles de microbes sur des milieux solides, 5) l'identification et l'isolement des organismes induisant putatif, et 6) qui confirme que ces micro-organismes ne activent en effet ce phénotype dans un écran secondaire. Une fois identifiés, ces organismes et de leurs métabolites nous fournissent des outils chimiques pour moduler le comportement des bactéries, pour étudier la physiologie bactérienne et interactions microbiennes, et d'agir éventuellement en tant que nouveaux échafaudages pour des composés thérapeutiques futures.

Protocol

Une. Sélectionner un gène rapporteur et un rapporteur fluorescent Construire transcriptionnelle Pour B. subtilis: Voir l'article JoVE en référence 19 pour un protocole décrivant la construction de journalistes transcription fluorescentes dans Bacillus subtilis. Pour d'autres espèces bactériennes: Identifier un gène qui est régulé à la hausse au cours de la réponse physiologiqu…

Representative Results

Cet écran est utilisé pour identifier les organismes du sol sécrétant des composés qui modifient la physiologie de B. subtilis. Les résultats décrits ici sont axées sur le type de cellule-matrice produisant de B. subtilis, qui produit la protéine et des exopolysaccharides qui sont nécessaires pour la formation de biofilm robuste dans cette bactérie. Nous avons choisi le promoteur de l'opéron Tapa-sipW-tasa pour notre construction rapporteur fluorescent (P Tapa-YFP).</e…

Discussion

Une des limites inhérentes à ce protocole est qu'il repose sur la cultivabilité d'organismes microbiens. Comme il a été bien documenté ^24, plus la vie microbienne sur la planète ne peut pas (encore) être cultivé dans les conditions de culture explorées à ce jour. Ainsi, un grand nombre d'interactions entre les espèces microbiennes qui se produisent dans les milieux naturels ne soit pas détecté en utilisant cette approche. Cependant, depuis notre désir est d'identifier non seulem…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.