Utilizzo di co-coltura per rilevare chimicamente mediata interspecie Interazioni

Summary

I batteri producono composti secreti che hanno il potenziale per influenzare la fisiologia dei loro vicini microbiche. Qui si descrive una schermata co-coltura che permette la rilevazione di tali interspecie interazioni mediate chimicamente mescolando microbi del suolo con fluorescenti ceppi giornalista trascrizionali di Bacillus subtilis su supporti solidi.

Abstract

In natura, i batteri esistono raramente in isolamento, sono invece circondati da una gamma diversificata di altri microrganismi che alterano l'ambiente locale secernendo metaboliti. Questi metaboliti hanno il potenziale di modulare la fisiologia e la differenziazione dei loro vicini microbiche e sono probabilmente fattori importanti per la creazione e il mantenimento di comunità microbiche complesse. Abbiamo sviluppato uno schermo coculture basato sulla fluorescenza per identificare tali interazioni microbiche mediate chimicamente. La schermata richiede la combinazione di un trascrizionale ceppo reporter fluorescente con i microbi ambientali su supporti solidi e permettendo le colonie di crescere in co-coltura. Il reporter trascrizionale fluorescente è progettato in modo che il ceppo batterico scelta fluorescente quando si esprime un particolare fenotipo di interesse (cioè la formazione di biofilm, sporulazione, la produzione di fattore di virulenza, ecc.) Lo screening viene effettuata in condizioni di crescita where questo fenotipo non è espressa (e quindi il ceppo giornalista è tipicamente non fluorescente). Quando un microbo ambientale secerne un metabolita che attiva questo fenotipo, si diffonde attraverso la agar e attiva il costrutto reporter fluorescente. Questo permette al inducendo–metabolita produzione microbo da rilevare: sono le colonie non fluorescente più prossimali alle colonie fluorescenti. Così, questa schermata permette l'identificazione di microbi ambientali che producono metaboliti diffusibili che attivano una particolare risposta fisiologica in un ceppo giornalista. Questa pubblicazione illustra come: a) selezionare adeguate condizioni di co-coltura di screening, b) preparare il giornalista e microbi ambientali per lo screening, c) eseguire lo schermo co-coltura, d) isolare putativo indurre gli organismi, ed e) confermano la loro attività in uno schermo secondario. Abbiamo sviluppato questo metodo per schermare per gli organismi del suolo che attivano biofilm matrice-produzione in Bacillus subtilis </em>, ma abbiamo anche discutere le considerazioni per l'applicazione di questo approccio ad altri batteri geneticamente trattabili.

Introduction

Siamo interessati a capire come i metaboliti che i batteri secernono influenzano la fisiologia e lo sviluppo di microbi vicini. Molti metaboliti sono stati caratterizzati per i loro effetti bioattivi su altri microbi. Due esempi ben descritti comprendono antibiotici, che inibiscono la crescita di altri microbi, e molecole quorum sensing, che alterano l'espressione genica globale di altri microbi. Tuttavia, i batteri producono molti altri piccoli prodotti naturali molecola che non hanno conosciuto bioattività ^1. Noi ipotizziamo che i batteri si sono evoluti e conservato la capacità di produrre alcuni di questi metaboliti perché consentono loro di modulare la fisiologia cellulare dei loro vicini microbica nelle comunità microbiche complesse all'interno delle quali esistono maggior parte dei batteri.

Tipi cellulari Bacillus subtilis

Abbiamo concentrato i nostri studi sulle interazioni microbiche mediate chimicamente che coinvolgono Bacilsubtilis LU. Questo non solo a causa del suo status di modello batterio Gram-positivi e gli strumenti genetici risultanti disponibili per la sua manipolazione, ma anche per la sua capacità di differenziarsi in tipi cellulari caratterizzati. Esempi includono cellule che sono: nuoto, producono la matrice extracellulare che è necessario per la formazione di biofilm robusta; competenti ad assumere DNA dall'ambiente e sporulanti, tra gli altri ^2. Ognuno di questi tipi di cellule esprime una caratteristica regulon trascrizionale che li rende fisiologicamente e / o fisicamente distinti dai loro fratelli geneticamente identici. Sotto molte condizioni di crescita, più tipi di cellule coesistono varie sottopopolazioni all'interno di una singola colonia di B. cellule subtilis ^3. Sebbene molte specie di batteri possono presentare analogo tipo cellulare eterogeneità, questo fenomeno è stato particolarmente studiato in B. subtilis.

In particolare, i geni che sono UPRegulated all'interno di ciascuno di questi specifici B. Sono stati identificati tipi cellulari subtilis. Identificare tali geni upregulated è essenziale per il lavoro qui descritto perché molti di questi fenotipi microbici di interesse sono difficili o impossibili da osservare direttamente. Per esempio, non siamo in grado di rilevare visivamente un tratto come il nuoto su solide (1,5%) piastre di agar, anche se una sottopopolazione di B. cellule subtilis producono flagelli in queste condizioni ^3. Un altro esempio è biofilm matrice-produzione. Produzione Matrix può essere visualizzato da morfologia delle colonie (come risulta nelle colonie macroscopicamente rugose), ma solo su determinati mezzo di crescita, e solo dopo diversi giorni di crescita ^4. Tuttavia, conoscendo quali geni sono upregulated durante la differenziazione, possiamo costruire reporter trascrizionali che agiscono come marcatori di differenziazione cellulare in questi tipi cellulari.

Costrutti reporter

Queste t fluorescentereporter ranscriptional costituiti dai promotori per i geni specifici di tipo a cella guidare la produzione di un gene reporter, per esempio una proteina fluorescente. Gli esempi includono P _HAG-YFP (per il nuoto celle), P _Tapa-YFP (per le celle della matrice che producono biofilm), e P _SSPB-YFP (per sporulanti celle), dove P _x indica la regione del promotore per il gene x. Questi costrutti reporter sono integrati in un locus neutro sul cromosoma (Figura 1 e, vedi sotto) in modo che la regolazione nativo del fenotipo è lasciata intatta. Tuttavia, ora quando una cellula esprime questo fenotipo, esprime anche una proteina fluorescente. Ciò fornisce un read-out facilmente visualizzati dell'attivazione del comportamento particolare fenotipica, che ci permette di screening per i microbi che attivano questa risposta fisiologica. Sebbene tali giornalisti sono comunemente utilizzati in microbiologia, non sono stati ampiamente applicati in schermi a identifinterazioni metaboliche y tra i microbi prima di questo metodo è stato descritto ^5.

Ci sono una serie di considerazioni importanti nella progettazione e costruzione di cellule-tipo-specifici ceppi Reporter. Abbiamo utilizzato reporter fluorescenti esclusivamente trascrizionali, sebbene altri tipi di costrutti sono certamente possibili. Noi scoraggiamo l'uso di fusioni traslazionali come marcatori per tipo di cellula differenziazione nel nostro schermo, però, per due motivi: 1) il desiderio di lasciare la cella-specifico del tipo proteina nativa imperturbabile, e 2) il riconoscimento che una diffusa, cellula- ampia fluorescenza sarà più facile da rilevare rispetto puncta localizzata all'interno delle cellule (comune con fusioni traslazionali).

Selezione gene reporter

Dopo aver deciso di utilizzare trascrizione come-out leggere, il gene reporter deve essere selezionata (ad esempio LacZ, fluorescenza, o luciferasi). LacZ ha il vantaggio di subire almeno specialezato apparecchiature per rilevare, ma vi è un rischio molto più elevato di falsi positivi tra microbi ambientali. Nelle nostre mani, il livello di Lac ⁺ organismi tra i microbi del suolo di sottofondo era proibitivo (>> 10% dei microbi del suolo erano blu (Lac ⁺⁾ su piastre X-gal, i dati non riportati). E 'possibile che titolando la concentrazione di X-gal in mezzo, questo potrebbe essere ottimizzata per consentire l'uso di un reporter X-gal, anche se non abbiamo tentato questa. Luciferase fornisce elevata sensibilità di rilevazione ed è il giornalista più ortogonale: non c'è quasi nessuna possibilità di microbi ambientali essendo luminescenti intrinsecamente. Tuttavia, abbiamo trovato difficile individuare la strumentazione presso il nostro istituto che ha permesso la rilevazione di luminescenza in intere lastre di Petri, come la maggior parte sono stati progettati per eseguire la scansione solo le regioni localizzate in piastre multi-pozzetto. Ci potrebbe anche essere complicazioni nella visualizzazione colonie luminescenti in un modo che ha permesso anche la fisica contemporanea èolation degli organismi inducono. Durante l'utilizzo fiduciari può aver reso possibile tutto questo, abbiamo invece deciso di utilizzare giornalisti trascrizionali fluorescenti, che sono stati dimostrato di funzionare in B. subtilis, purché adeguata sensibilità di rilevazione e di bassi tassi di falsi positivi tra gli organismi del suolo, e ha permesso di utilizzare facilmente di strumentazione disponibile sia per la visualizzazione e procedure di isolamento.

Selezione fluoroforo

Il fluoroforo specifica scelta dipenderà dalla vostra specie batteriche, il mezzo di agar di crescita che si sta utilizzando, e la particolare filtro di fluorescenza imposta che avete a disposizione. Con la nostra strumentazione, abbiamo scoperto che sia la B. subtilis se stessi e l'agar sono state coltivate su esposto sfondo meno fluorescenza quando sono stati usati filtri YFP (proteina fluorescente gialla), rendendo il giornalista superiore a GFP (green fluorescent protein) nelle nostre mani colonie. Il codon usage di proteine ​​fluorescenti sonofrequentemente ottimizzato per eucarioti, che rende importante scegliere un fluoroforo sia noto dalla letteratura per lavorare nei vostri specie batteriche, o per testare esplicitamente utilizzando un promotore costitutivo. Un gran numero di continua evoluzione varianti proteiche fluorescente sono attualmente disponibili ^6, che sono stati esaminati in un certo numero di fonti di ^7,8, alcune delle quali prevedono esplicitamente una guida su come scegliere una proteina fluorescente appropriato per l'esperimento ^9.

Selezione Promoter

La scelta di un promotore dipenderà in gran parte dal tipo di cellulare o fenotipo di interesse. Per organismi come B. subtilis, alcuni specifici geni reporter cellula-tipo sono state stabilite in letteratura. Per gli altri ceppi batterici, l'esame microarray o dati trascrizionali sarà necessario fornire informazioni su quali geni sono altamente upregulated nelle condizioni in cui il tipo di cellule di interesse is manifesto. Uno studio recente catalogato la trascrizione di B. subtilis inferiore a 104 diverse condizioni di crescita utilizzando microarrays piastrellatura ^10. Questo documento fornisce informazioni complete su quali geni sono altamente sovraregolati in condizioni differenti, che è prezioso per fenotipi meno ben caratterizzati.

Invece di mappatura regioni promotrici precise per ogni gene di interesse, di solito è sufficiente utilizzare la sequenza di 200-500 bp a monte del gene come il promotore. La lunghezza esatta sequenza dipende dal contesto genomico: regioni corte vengono utilizzate quando necessario per evitare comprese le regioni codificanti monte dalla vicina open reading frame.

Loci Neutro e l'integrazione

Come mantenere il costrutto giornalista nel vostro ceppo batterico diventa la domanda finale nella progettazione di una fluorescente ceppo trascrizionale giornalista. Nei batteri, i geni di interesse sono spesso mantenutesu plasmidi che utilizzano la selezione antibiotica. Tuttavia, potrebbe non essere possibile usare antibiotici durante coculture senza uccidere i microbi ambientali. Se plasmidi sono stabilmente mantenuti nelle specie batteriche, potrebbe essere possibile crescere i vostri batteri che contiene un plasmide reporter-borne in presenza di antibiotici per preparare il giornalista per lo screening, e quindi eliminare gli antibiotici durante la co-coltura stessa, nella speranza che il plasmide sarà essere mantenuto sufficientemente per consentire fluorescenza. Tuttavia, se i plasmidi possono essere facilmente perse nel batterio, o si perdono in condizioni di stress, questo non sarà una valida opzione. In molti casi, la soluzione migliore sarà l'integrazione del costrutto giornalista sul cromosoma batterico, che permette il mantenimento stabile del reporter anche in assenza di selezione. Affinché l'integrazione per non disturbare la normale espressione o il regolamento del gene di interesse, si consiglia di integrare in un sito ectopica sul cromosoma che can agire come un "locus neutrale". In B. subtilis questi siti integrazione sono geni che – se mutati – trasmettere un fenotipo in alcuni media minima (permettendo integrants di identificare senza selezione antibiotico), ma non modificare i tassi di crescita o sporulazione in rich media, e includere tali geni come amyE, Laca, THRC, pyrD, gltA, e SACA (trasmettere la capacità di utilizzare l'amido, β-galattosidi, treonina, uracile, glutammato, e saccarosio, rispettivamente) ^11-13.

Mentre l'integrazione in questi geni sono stati utilizzati in modo affidabile per molti anni a B. subtilis (in particolare a amyE e Laca), la conoscenza simile potrebbe non essere disponibile per i geni in molte altre specie batteriche. L'uso di siti di attaccamento fagi sono ottime alternative per siti di integrazione cromosomiche neutri: molte specie-specifico ^14-16, così come i siti generali di integrazione, come il sito di attacco TN7 (att TN7) hannostate identificate e utilizzate per inserimenti gene in molte specie batteriche ^17,18.

Microbi ambientali

Usiamo suolo come fonte diretta di microbi ambientali per il nostro schermo co-coltura. Il terreno contiene una grande diversità di microbi, e molti di questi organismi sono ricca fonte di prodotti naturali. Utilizzando sospensioni liquide di terreno collocati direttamente sulle piastre con il nostro fluorescente ceppo giornalista trascrizionale (senza isolare batteri dal suolo), si semplificare notevolmente l'approccio sperimentale. Il terreno può essere utilizzata immediatamente dopo la raccolta, o essere congelato a -80 ° C per un uso futuro. Uso immediato ha il vantaggio che una maggiore diversità di microbi possono potenzialmente essere coltivate, compresi quelli che non sopravviverà congelamento bene. Esso ha lo svantaggio che la concentrazione degli organismi del terreno coltivabili da questi campioni è sconosciuto, aumentando il numero di piastre di schermo che deve essere utilizzato. Deluso ayed ha il vantaggio che i cfu / ml per ciascuna sorgente suolo possono essere determinati in anticipo, consentendo un numero ottimizzato di colonie di essere coltivate su ciascuna piastra schermo. Tuttavia, esso richiede che gli organismi del suolo siano in grado di sopravvivere congelamento.

Si noti che la diversificazione della piscina induttore in fase di esame (cioè le fonti del suolo) sembra essere più efficace a individuare nuove interazioni interspecie dello screening approfondito sullo stesso terreno: maggiore diversità filogenetica è stato osservato nei risultati individuati nel nostro schermo a matrice induzione Fonti del suolo supplementari sono stati esaminati, piuttosto che di screening le stesse fonti suolo più a fondo (EA Tibia e R. Kolter, Harvard Medical School, risultati non pubblicati).

Panoramica

L'approccio che descriviamo qui è semplice in termini di requisiti tecnici. Si tratta di: 1) costruire una trascrizionale reporter fluorescente in B. subtilis o unaltre specie batteriche di interesse, 2) le condizioni di questo giornalista non è attivato di identificazione, 3) preparazione di aliquote di questo ceppo giornalista e organismi che saranno proiettati (nel nostro caso del suolo, ma altre fonti potrebbero essere utilizzati al posto), 4) mescolando questi due gruppi di microbi su supporti solidi, 5) individuare e isolare putativo inducendo organismi e 6), a conferma che questi organismi effettivamente attivano questo fenotipo in uno schermo secondario. Una volta identificati, questi organismi e dei loro metaboliti ci forniscono gli strumenti chimici per modulare il comportamento dei batteri, per studiare la fisiologia dei batteri e delle interazioni microbiche, e di agire come potenzialmente nuovi ponteggi per i composti terapeutici futuri.

Protocol

1. Selezionare un gene reporter e costruire un reporter fluorescente trascrizionale Per B. subtilis: Vedi l'articolo JoVE in riferimento 19 per un protocollo che descrive la costruzione di giornalisti trascrizionali fluorescenti in Bacillus subtilis. Per le altre specie batteriche: Identificare un gene che è upregulated durante la risposta fisiologica di interesse. Questo può essere basata …

Representative Results

Questo schermo è stato utilizzato per identificare organismi del suolo secernono sostanze che alterano la fisiologia di B. subtilis. I risultati qui descritti concentrano sul tipo di cellula matrice produttrici di B. subtilis, che produce la proteina e esopolisaccaride che sono necessari per la formazione di biofilm robusta in questo batterio. Abbiamo scelto il promotore dell'operone Tapa-sipW-ATAS per il nostro costrutto reporter fluorescente (P tapa-YFP). Questo oper…

Discussion

Uno dei limiti intrinseci di questo protocollo è che si basa sulla coltivabilità degli organismi microbici. Come è stato ben documentato ^24, più la vita microbica del pianeta non può (ancora) essere coltivata nelle condizioni di coltura esplorati fino ad oggi. Così, un enorme numero di interazioni tra le specie microbiche che si stanno verificando in ambienti naturali passeranno inosservati utilizzando questo approccio. Tuttavia, poiché il nostro desiderio è quello di individuare non solo l'esiste…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.