Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

Summary

Bakterien produzieren sezernierten Verbindungen, die das Potenzial, die Physiologie der Mikroorganismen ihre Nachbarn beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Co-Kultur Bildschirm, der Nachweis solcher chemisch vermittelte Inter Wechselwirkungen durch Mischen von Bodenmikroben mit fluoreszierenden Reporter-Transkriptions Stämmen von Bacillus subtilis auf festen Medien ermöglicht.

Abstract

In der Natur, Bakterien existieren selten isoliert, sondern werden durch eine Vielfalt von anderen Mikroorganismen, die die lokale Umwelt zu verändern durch Sekretion von Metaboliten umgeben. Diese Metaboliten haben das Potenzial, die Physiologie und die Differenzierung ihrer mikrobielle Nachbarn modulieren und sind wahrscheinlich wichtige Faktoren bei der Errichtung und Instandhaltung von komplexen mikrobiellen Gemeinschaften. Wir haben eine Fluoreszenz-basierten Kokultur Bildschirm, um solche chemisch vermittelte mikrobielle Wechselwirkungen identifizieren. Der Bildschirm beinhaltet die Kombination eines fluoreszierenden Reporterstamm mit Transkriptionsumwelt Mikroben auf festen Medien und so die Kolonien in Co-Kultur wachsen. Die Leuchtstofftranskriptions Reporter ist so konzipiert, dass die gewählte Bakterienstamm fluoresziert, wenn es einen bestimmten Phänotyp von Interesse exprimieren (dh die Biofilmbildung, Sporenbildung, Virulenzfaktor Produktion, etc.) Screening ist unter Wachstumsbedingungen durchgeführt wheWieder dieser Phänotyp nicht exprimiert wird (und damit der Reporter-Stamm ist in der Regel nicht fluoreszierend). Wenn ein Umwelt Mikrobe sondert ein Metabolit, der diesen Phänotyp aktiviert, diffundiert es durch den Agar und aktiviert die fluoreszierenden Reporter-Konstrukt. Dies ermöglicht die Induzierung Metaboliten produzierenden Mikroben nachzuweisenden: sie sind nicht-fluoreszierenden Kolonien meisten proximal zu den fluoreszierenden Kolonien. Somit ermöglicht dieser Bildschirm die Ermittlung von Umwelt Mikroben, die diffusionsfähige Metaboliten, die eine bestimmte physiologische Reaktion in einem Reporterstamm aktivieren produzieren. Diese Publikation beschreibt, wie: a) wählen Sie die entsprechende Co-Kultur Screeningbedingungen, b) bereiten die Reporter und Umwelt Mikroben für Screening, c) führen die Co-Kultur-Bildschirm, d) zu isolieren mutmaßlichen Induktion Organismen, und e) bestätigen ihre Tätigkeit in einem zweiten Bildschirm. Wir haben diese Methode, um für Bodenorganismen, die Biofilmmatrix-Produktion in Bacillus subtilis aktivieren Bildschirm </em>, aber wir diskutieren auch Überlegungen für die Anwendung dieses Ansatzes auf andere genetisch manipulierbaren Bakterien.

Introduction

Wir interessieren uns für das Verständnis, wie die Metaboliten, die Bakterien absondern, beeinflussen die Physiologie und die Entwicklung der Nachbar Mikroben. Viele Metaboliten wurden für ihre bioaktiven Effekte auf andere Mikroben gekennzeichnet. Zwei gut beschriebenen Beispiele sind Antibiotika, die das Wachstum anderer Mikroorganismen hemmen und Quorum Sensing-Moleküle, die die globale Genexpression von anderen Mikroben zu ändern. Allerdings Bakterien produzieren viele andere kleine Molekül natürlichen Produkten, die keine bekannten Bioaktivitäten ¹ haben. Wir vermuten, dass Bakterien entwickelt haben und erhalten die Möglichkeit, einige dieser Stoffwechselprodukte, weil sie es ihnen ermöglichen, die zelluläre Physiologie ihrer mikrobielle Nachbarn in den komplexen mikrobiellen Gemeinschaften, in dem die meisten Bakterien existieren modulieren.

Bacillus subtilis Zelltypen

Wir haben unsere Studien über chemisch vermittelte mikrobielle Interaktionen, die bacil beinhalten konzentriertlus subtilis. Dies ist nicht nur wegen ihres Status als den gram-positiven Bakterium Modell und den daraus resultierenden genetischen Werkzeuge für seine Betätigung zur Verfügung, sondern auch wegen seiner Fähigkeit, gekennzeichnet Zelltypen. Beispiele sind Zellen, die sind: Schwimmen, Herstellung der extrazellulären Matrix, die für robuste Biofilmbildung erforderlich ist; zuständigen aufnehmen DNA aus der Umgebung, und sporenbildenden, unter anderen ^zwei. Jeder dieser Zelltypen exprimiert ein Merkmal Transkriptions-Regulon, das sie physiologisch und / oder physikalisch von den genetisch identischen Geschwistern macht. Unter vielen Wachstumsbedingungen, mehreren Zelltypen existieren verschiedene Subpopulationen innerhalb einer einzigen Kolonie von B. subtilis-Zellen ^3. Obwohl viele Arten von Bakterien können analog Zelltyp Heterogenität aufweisen, dieses Phänomen wurde besonders gut in B. studierte subtilis.

Insbesondere sind Gene, die UPRInnerhalb jeder dieser spezifischen B egulated subtilis Zelltypen identifiziert worden. Identifizieren solcher hochregulierte Gene ist für die hier beschriebene Arbeit, weil viele dieser mikrobiellen Phänotypen von Interesse schwierig oder unmöglich direkt zu beobachten sind. Zum Beispiel können wir nicht visuell ein Merkmal zu erkennen, wie Schwimmen auf solide (1,5%)-Agar-Platten, auch wenn eine Subpopulation von B. subtilis-Zellen produzieren Geißeln unter diesen Bedingungen ^3. Ein weiteres Beispiel ist Biofilmmatrix-Produktion. Matrixproduktion durch Koloniemorphologie sichtbar gemacht werden (wie es in makroskopisch faltige Kolonien führt), sondern nur auf bestimmte Wachstumsmedium, und erst nach mehreren Tagen des Wachstums ^4. Doch wir wissen, welche Gene während der Differenzierung hochreguliert, können wir Transkriptions Reportern, die als Marker für zelluläre Differenzierung in diesen Zelltypen wirken zu konstruieren.

Reporter-Konstrukte

Diese Fluoreszenz transcriptional Reporter aus den Promotoren für die Zelltyp-spezifische Gene Antreiben der Herstellung eines Reportergens, zum Beispiel ein fluoreszierendes Protein ist. Beispiele umfassen P _hag-YFP (zum Schwimmen Zellen), P _Tapa-YFP (für Biofilm-Matrix-produzierenden Zellen) und P _SSPB-YFP (für sporen Zellen), wobei P _x die Promotorregion für die Gen-x. Diese Reporterkonstrukte werden in einem neutralen Locus auf Chromosom integriert (Fig. 1 und siehe unten), so daß das native Regelung der Phänotyp bleibt intakt. Aber jetzt, wenn eine Zelle diesen Phänotyp exprimiert, es drückt auch ein fluoreszierendes Protein. Dies stellt eine leicht visualisiert Auslesen der Aktivierung bestimmter phänotypisches Verhalten, so dass wir für diese Mikroben, die physiologische Reaktion zu aktivieren screenen. Obwohl solche Journalisten werden häufig in der Mikrobiologie eingesetzt, sie wurden nicht weitgehend Bildschirme identif angewendety metabolische Wechselwirkungen zwischen Mikroben vor dieser Methode wurde ⁵ beschrieben.

Es gibt eine Anzahl von wichtigen Überlegungen bei der Gestaltung und Konstruktion von Zelltyp-spezifischen Reporterstämmen. Wir haben ausschließlich Transkriptions fluoreszierenden Reportern verwendet, obwohl andere Typen von Konstrukten sind sicherlich möglich. Wir raten von der Verwendung der translationalen Fusionen als Marker für Zelltyp Differenzierung in unserem Bildschirm, jedoch aus zwei Gründen: 1) der Wunsch, die nativen Zelltyp-spezifischen Protein unbeeindruckt lassen, und 2) die Erkenntnis, dass eine diffuse, Zell- breite Fluoreszenz wird leichter zu erkennen als in den Zellen lokalisiert puncta (gemeinsam mit translationale Fusionen).

Reporter-Gen-Auswahl

Nach der Entscheidung, die Transkription als Auslese verwenden, muss der Reporter-Gen ausgewählt werden (zB LacZ, Fluoreszenz oder Luciferase). LacZ hat den Vorteil, benötigen mindestens die SonderIzed Ausrüstung, um zu erkennen, aber es gibt eine viel höhere Wahrscheinlichkeit von Fehlalarmen unter Umwelt Mikroben. In unseren Händen, der Hintergrundpegel von Lac ⁺ Organismen unter Bodenmikroben war unerschwinglich hoch (>> 10% der Bodenmikroben waren blau (Lac ⁺⁾ auf der X-Gal-Platten, Daten nicht gezeigt). Es ist möglich, dass durch Titrieren der Konzentration von X-gal in dem Medium, das könnte optimiert werden, um die Verwendung einer X-Gal-Reporter ermöglichen, obwohl wir nicht versucht dieses. Luciferase eine hohe Nachweisempfindlichkeit und ist die orthogonale Reporter: Es gibt nahezu keine Chance Umweltmikroben inhärent Leucht. Allerdings fanden wir es schwierig, Instrumentierung an unserer Hochschule, die Lumineszenzdetektion erlaubt über die gesamte Petrischalen zu identifizieren, da die meisten wurden entwickelt, um nur lokalisierte Bereiche in Multi-Well-Platten zu scannen. Es könnte auch Komplikationen bei der Visualisierung Leucht Kolonien in einer Weise, die auch erlaubt die gleichzeitige körperliche ist seinBildung von Ol-Organismen zu induzieren. Bei der Verwendung von Treuhändern kann dies möglich gemacht haben, haben wir entschieden, statt Transkriptions fluoreszierenden Reporter, die bewiesen wurden in B. arbeiten, verwenden subtilis, sofern ausreichende Nachweisempfindlichkeit und niedrige False-Positive-Raten unter den Bodenorganismen und erlaubt, von leicht verfügbaren Instrumente sowohl für die Visualisierung und Isolierungsverfahren zu verwenden.

Fluorophor-Auswahl

Die spezifische Fluorophor ausgewählt werden auf Ihrem Bakterienarten ab, die Agar-Nährmedium Sie verwenden, und die insbesondere Fluoreszenzfilter setzt Sie zur Verfügung haben. Mit unserer Messtechnik, haben wir festgestellt, dass sowohl die B. subtilis Kolonien selbst und die sie auf Agar zeigten weniger Hintergrundfluoreszenz gewachsen, wenn YFP (gelb fluoreszierendes Protein)-Filter verwendet wurden, so dass Reporter überlegen GFP (green fluorescent protein) in unseren Händen. Die Codon-Verwendung von fluoreszierenden Proteinen sindhäufig für Eukaryoten optimiert, so dass es wichtig ist, eine Fluorophor entweder aus der Literatur bekannt, in Ihrem Bakterienarten zu arbeiten, oder sie explizit über einen konstitutiven Promotor testen auswählen. Eine große Anzahl von sich ständig weiterentwickelnden fluoreszierenden Protein-Varianten sind derzeit verfügbar ^6, die in einer Reihe von Quellen, ^7,8, von denen einige Leitlinien ausdrücklich vor, auf die Auswahl eines geeigneten Fluoreszenzprotein für Ihr Experiment ⁹ wurde bewertet haben.

Promoter Auswahl

Die Auswahl eines Promotors wird weitgehend auf Zelltyp oder Phänotyp von Interesse ab. Für Organismen wie B. subtilis wurden einige Zelltyp-spezifische Reportergene in der Literatur etabliert. Für andere Bakterienstämme, werden untersucht Mikroarray-oder Transkriptions Daten erforderlich sein, Informationen darüber, welche Gene stark unter den Bedingungen hochreguliert werden bieten, wo Ihr Zelltyp von Interesse is manifestierten. Eine aktuelle Studie katalogisiert die Transkription von B. subtilis unter 104 verschiedenen Wachstumsbedingungen mit ¹⁰ Fliesen-Microarrays. Dieses Papier bietet umfassende Informationen darüber, welche Gene sind stark unter verschiedenen Bedingungen hochreguliert, die von unschätzbarem Wert für weniger gut charakterisierten Phänotypen ist.

Anstatt genaue Kartierung Promotorregionen für jedes Gen von Interesse, wir verwenden in der Regel einfach die Sequenz 200-500 bp stromaufwärts des Gens als Promotor. Der genaue Ablauf Länge ist abhängig von der genomischen Kontext: kürzere Regionen verwendet werden, wenn notwendig, um zu vermeiden, einschließlich der vor-kodierenden Regionen aus Nachbar offene Leserahmen.

Neutral Loci und Integration

Wie pflegen Sie die Reporter Konstrukt in Ihrem Bakterienstamm wird die letzte Frage bei der Gestaltung eines fluoreszierenden Transkriptions-Reporter-Stamm. In Bakterien sind die Gene von Interesse häufig beibehaltenauf Plasmiden mit antibiotischer Selektion. Jedoch kann es nicht möglich sein, während der Co-Kultur ohne Antibiotika töten die Umweltmikroben verwendet werden. Wenn Plasmide stabil in Ihrer Bakterienarten gehalten, kann es möglich sein, das Wachstum Ihres Bakterien, die ein Plasmid-borne Reporter in Gegenwart von Antibiotika, um Ihre Reporter für das Screening vorbereiten und dann zu beseitigen Antibiotika während der Co-Kultur selbst, in der Hoffnung, dass das Plasmid wird ausreichend aufrechterhalten werden, um Fluoreszenz zu ermöglichen. Allerdings, wenn Plasmide sind leicht in Ihre Bakterium verloren, oder werden unter Stressbedingungen verloren, wird dies nicht eine sinnvolle Option sein. In vielen Fällen ist die beste Lösung, um das Reporterkonstrukt auf dem bakteriellen Chromosom, das die stabile Aufrechterhaltung des Reporter auch in Abwesenheit von Selektion ermöglicht integrieren. Um für die Integration, um die normale Expression oder Regulation des Gens von Interesse nicht zu stören, empfehlen wir, in einer Eileiter Website integrieren auf dem Chromosom, dass CAn als handeln "neutralen Ort". In B. subtilis diese Integrationsstellen sind Gene, die – wenn sie mutiert sind – vermitteln einen Phänotyp in bestimmten Minimalmedien (so dass Integranten ohne Antibiotika-Selektion identifiziert werden kann), aber nicht Wachstum oder Sporenbildung Raten in Rich-Media verändern und umfassen solche Gene als amyE, lacA, thrC pyrD, gltA und sacA (Fördern der Fähigkeit, Stärke zu nutzen, β-Galactosidasen, Threonin, Uracil, Glutamat und Saccharose, jeweils) ^11-13.

Während die Integration in diesen Genen haben viele Jahre zuverlässig in B verwendet wurde subtilis (insbesondere bei amyE und lacA) können ähnliche Wissen nicht für Gene, die in vielen anderen Bakterienarten zur Verfügung. Der Einsatz von Phagen-Bindungsstellen sind gute Alternativen für neutrale chromosomalen Integrationsstellen: Viele Spezies-spezifische ^14-16, sowie allgemeine Integrationsstellen wie dem Tn7 Befestigungsstelle (att Tn7) habenidentifiziert worden, und in vielen Bakterienarten ^17,18 für die Gen-Insertionen verwendet.

Umweltmikroben

Wir verwenden Boden als direkte Quelle von Umweltmikroben für unsere Co-Kultur-Bildschirm. Der Boden enthält eine große Vielfalt an Mikroorganismen, und viele dieser Organismen sind reich an natürlichen Produkten. Durch die Verwendung von flüssigen Suspensionen von Boden direkt auf Platten mit unseren Transkriptions fluoreszierenden Reporter-Stamm (ohne vorherige Isolierung von Bakterien aus dem Boden) gelegt, wir vereinfachen den experimentellen Ansatz. Der Boden kann entweder unmittelbar nach der Ernte verwendet werden oder bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung eingefroren werden. Sofortige Anwendung hat den Vorteil, dass eine größere Vielfalt von Mikroben kann möglicherweise aufgewachsen werden, einschließlich derjenigen, die nicht überleben Einfrieren gut. Es hat den Nachteil, dass die Konzentration der Anbaubodenorganismen aus diesen Proben nicht bekannt ist, die Anzahl von Siebplatten, die verwendet werden müssen. Delayed Verwendung hat den Vorteil, dass die KBE / ml für jeden Boden Quelle kann im Voraus bestimmt werden, so dass eine optimierte Anzahl der Kolonien, die auf jeder Bildschirmplatte angebaut werden. Allerdings erfordert es, dass die Bodenorganismen überlebensfähig Gefrierpunkt.

Beachten Sie, dass die Diversifizierung der Induktor Pool wird (dh den Bodenquellen) untersucht zu sein scheint, bei der Identifizierung neuer Inter Wechselwirkungen als eingehende Screening auf demselben Boden effektiver: mehr phylogenetischen Vielfalt wurde in den in unserer Matrix-Bildschirm, wie Induktions identifizierten Hits beobachtet zusätzlichen Bodenquellen wurden anstatt Screening der gleichen Erde Quellen gründlicher (EA Shank und R. Kolter, Harvard Medical School, unveröffentlichte Ergebnisse) untersucht.

Überblick

Der Ansatz, den wir hier beschreiben, ist einfach in seiner technischen Anforderungen. Es beinhaltet: 1) Konstruktion eines fluoreszierenden Reporter-Transkriptions in B. subtilis oderandere Bakterienspezies von Interesse, 2) Identifizieren Bedingungen, unter denen der Reporter nicht aktiviert ist, 3) Herstellung von Aliquots dieser Reporter-Stamm und Organismen gescreent werden (in diesem Fall Erde, aber andere Quellen könnten stattdessen verwendet werden), 4) Mischen derselben zwei Sätze von Mikroben auf festen Medien, 5) Identifizierung und Isolierung von mutmaßlichen Induktion Organismen, und 6), die bestätigt, dass diese Organismen tatsächlich diesen Phänotyp in einem sekundären Bildschirm zu aktivieren. Einmal identifiziert, diese Organismen und deren Stoffwechsel uns mit chemischen Methoden, um bakterielle Verhalten modulieren, um bakteriellen Physiologie und mikrobielle Wechselwirkungen zu untersuchen und möglicherweise handeln als neue Gerüste für zukünftige therapeutische Verbindungen.

Protocol

1. Wählen Sie ein Reporter Gene und Konstruieren Sie eine Leuchtstofftranskriptions Reporter Für B. subtilis: Siehe den Artikel in JoVE Referenz 19 für ein Protokoll beschreibt die Konstruktion von fluoreszierenden Reporter-Transkriptions in Bacillus subtilis. Für andere Bakterienarten: Identifizieren ein Gen, das bei der physiologischen Reaktion von Interesse hochreguliert wird. Dies kann au…

Representative Results

Dieser Bildschirm wurde verwendet, um Bodenorganismen zu identifizieren sezer Verbindungen, die die Physiologie von B. ändern subtilis. Die hier beschriebenen Ergebnisse konzentrieren sich auf die Matrix-produzierenden Zelltyp von B. subtilis, die das Protein und Exopolysaccharid, die für robuste Biofilmbildung in diesem Bakterium benötigt werden produziert. Wir haben uns für den Promotor des Tapa-sipW Tasa-Operon für unsere fluoreszierenden Reporter-Konstrukt (P Tapa-YF…

Discussion

Eine der inhärenten Beschränkungen des Protokolls ist, dass es auf der Kultivierbarkeit von mikrobiellen Organismen beruht. Wie gut dokumentiert ^24, die meisten mikrobiellen Lebens auf dem Planeten kann (noch) nicht unter den Kulturbedingungen bis heute erforscht angebaut werden. So wird eine große Anzahl von Interaktionen zwischen Mikrobenarten, die in natürlicher Umgebung auftreten, unerkannt mit diesem Ansatz. Da unser Wunsch ist es, die Existenz solcher Wechselwirkungen nicht nur zu identifizieren, da…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.