Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres
Summary
Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.
Abstract
Des niveaux élevés d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) peuvent entraîner une modification de l'état redox cellulaire vers l'état de stress oxydatif. Cette situation provoque l'oxydation de molécules (lipides, ADN, protéines) et conduit à la mort cellulaire. Le stress oxydatif a également un impact sur la progression de plusieurs pathologies telles que le diabète, les rétinopathies, la neurodégénérescence, et le cancer. Ainsi, il est important de définir des outils pour étudier les conditions de stress oxydatif, non seulement au niveau des cellules individuelles, mais aussi dans le contexte des organismes entiers. Ici, nous considérons l'embryon de poisson zèbre comme un utile système in vivo pour effectuer des études et présenter un protocole pour mesurer le stress oxydatif in vivo. Profitant de sondes fluorescentes ROS et des lignes fluorescentes de poisson zèbre transgénique, nous développons deux méthodes différentes pour mesurer le stress oxydatif in vivo: i) un "embryon toute méthode ROS-détection" pour la mesure qualitative du stress oxydatif et ii) un "unicellulaire ROS méthode de détection "pour des mesures quantitatives de stress oxydatif. Ici, nous démontrons l'efficacité de ces procédés, en augmentant le stress oxydatif dans les tissus par des agents oxydants et des méthodes physiologiques ou génétiques. Ce protocole est prête pour les écrans génétiques avant et il aidera relations adresse de cause à effet de ROS dans des modèles animaux de pathologies liées au stress oxydatif, comme les troubles neurologiques et le cancer.
Introduction
Le stress oxydatif est spécifiquement définie comme un état qui résulte d'un état redox cellulaire asymétrique. Les réactions d'oxydoréduction complexes qui se produisent régulièrement dans les cellules déterminent l'état redox cellulaire. Les réactions d'oxydoréduction sont constitués de toutes les réactions chimiques qui se composent dans le transfert d'électrons entre les atomes des molécules biologiques produisant la réduction et l'oxydation de molécules (à savoir les réactions d'oxydo-réduction). Ces réactions sont catalysées par des espèces activées électroniquement (par exemple des espèces pro-oxydantes), qui se caractérisent par une extrême instabilité structurelle et activation spontanée d'électrons asymétriques qui échangent avec les biomolécules voisins. Ces réactions résultent en irréguliers dommages à l'ADN, des protéines carboxylation, et l'oxydation des lipides, et peuvent conduire à une mort cellulaire 1. Des niveaux accrus de stress oxydatif ont été associées avec le vieillissement et la progression de différents états pathologiques 2. Le stress oxydatif aété signalé comme étant responsable de modifications vasculaires dans le diabète et les maladies cardio-vasculaires 3,4. Il joue également un rôle critique dans la dégénérescence neuronale dans la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson 5. En outre, le stress oxydatif a été démontré comme un facteur essentiel dans la gouvernance progression du cancer et les événements métastatiques 6,7. En outre, les réponses inflammatoires et immunitaires peuvent susciter et à soutenir davantage le stress oxydatif 8.
Dans les cellules vivantes, les espèces pro-oxydantes sont dérivées de l'oxygène (ROS, les espèces réactives de l'oxygène) ou de l'azote (RNS; espèces réactives de l'azote). ROS comprennent le radical hydroxyle, l'anion superoxyde (OH.) (O 2 -), et le peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2). Le principal RNS est l'oxyde nitreux (NO).. Une série d'espèces réactives secondaires peut être généré par des interactions spontanées entrn ROS et RNS ou les ions métaux libres 9. Par exemple, l'anion superoxyde réagit avec l'oxyde nitreux pour former peroxynitrate (ONOO -), tandis que H 2 O 2 avec la réaction Fe 2 + génère des radicaux hydroxyle. ROS et RNS, en raison de leur capacité à réagir avec plusieurs biomolécules, sont considérés comme une menace dangereuse pour le maintien de l'état redox physiologiques 10. Pour maintenir les cellules de l'état d'oxydo-réduction sont équipées d'une série de détoxification de molécules anti-oxydantes et les enzymes. La superoxyde dismutase (SOD), catalase, glutathion peroxydase et peroxyrédoxines constitue essentiellement l'anti-oxydant enzymatique-arsenal qui fournit une protection cellulaire à partir d'espèces pro-oxydantes, y compris H 2 O 2, OH et OONO -. 11. Également des molécules anti-oxydantes comme la vitamine C et E, polyphénols et CoenzymeQ10 (CoQ10) sont d'une importance critique pour étancher ROS et leur dangereux derivatives 12,13. Cependant, une production excessive des ROS et RNS ou un dysfonctionnement dans le système anti-oxydant, déplace l'état redox cellulaire vers stress oxydatif 14.
Outre leur connotation négative, ROS peut jouer différents rôles physiologiques dans les cellules d'origine différente. Les cellules produisent normalement ROS comme molécules de signalisation de la médiation des événements biologiques normaux tels que la défense de l'hôte et la réparation des plaies 15-17. Les espèces réactives sont normalement produites dans les cellules par des enzymes intracellulaires telles que NOx (NADPH oxydase) et XO (xantine oxydase) en réponse à des facteurs de signalisation, des facteurs de croissance, et des fluctuations de niveaux intracellulaires de calcium 18,19. Il a été rapporté que les ROS peut différentiellement moduler l'activité des facteurs nucléaires importantes telles que p53 ou des composants cellulaires tels que l'ATM-kinase, un régulateur maître de la réponse aux dommages de l'ADN 20. Analogue ROS influencent fortement la signalisation cellulaire par la médiation eoxydation de e et l'inactivation des protéines tyrosine phosphatases (PTP), qui sont établis en tant que régulateurs critiques de la transduction du signal 21. En outre, la protéomique basée méthodologies démontrent que RNS sont également responsables de modifications et altérations de la signalisation moléculaire de protéines spécifiques. RNS réagissent avec les groupements thiols de cystéine en les modifiant en S-nitrothiols (SNO) et de déclenchement voies moléculaires concomitantes avec des états pathologiques tels que les maladies inflammatoires et auto-immunes 22,23.
Etant donné que des expériences de culture cellulaire ne se reproduisent que partiellement la multitude de facteurs qui agissent in vivo, il est d'un grand intérêt de réaliser des études d'oxydo-réduction dans les modèles animaux 24,25. Pour ce faire, le poisson-zèbre a été considéré comme un modèle animal vertébré approprié pour étudier la dynamique de stress oxydatif 26. Le poisson zèbre est un nouveau système de modèle qui accorde plusieurs avantages pour étudier les événements cellulaires et génétiques au cours des vertébrés developpement et la maladie. Grands groupes d'embryons hebdomadaire peuvent être générées et disponibles pour des besoins expérimentaux. En outre, la clarté optique extraordinaire embryons de poisson zèbre, ainsi que leur petite taille, permet l'imagerie cellulaire unique et le suivi dynamique dans toute une organismes 27. Dans la dernière décennie, un nombre considérable de mutants de poisson zèbre a été générée pour modéliser des conditions pathologiques comme le cancer et les maladies génétiques 28-31. Plus important encore, une multitude de lignées transgéniques ont été produites pour permettre de nombreuses possibilités de manipulations génétiques et biologiques 32. Par exemple, des lignées spécifiques de tissus de poisson-zèbre transgénique sont régulièrement utilisés pour des études in vivo. Ces lignées expriment une protéine fluorescente sous le contrôle d'un promoteur choisi, en offrant la possibilité d'identifier des cellules individuelles in vivo, ainsi que la structure anatomique qu'elles comprennent.
Plusieurs études toxicologiques ont déjà utilisé til de poisson zèbre pour évaluer l'effet in vivo de produits chimiques sur homéostasie redox, suggérant la pertinence de ce vertébré comme un modèle animal pour le domaine de la découverte de médicaments et le stress oxydatif 33-35. Même si certains des sondes fluorescentes ont été testés pour surveiller le stress oxydatif chez les larves de poisson zèbre 36,37, il n'y a pas de tests mis en place pour détecter et mesurer les niveaux de stress oxydatif dans les tissus de poisson zèbre et les cellules vivantes. Ici, nous décrivons un procédé pour la quantification in vivo du stress oxydatif dans les cellules d'embryons de poisson zèbre vivant. Les outils d'imagerie, tri FACS, des sondes fluorescentes et les conditions pro-oxydantes sont combinés pour générer simple test pour la détection et la quantification des espèces oxydantes dans des embryons et des tissus de poisson zèbre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques
La procédure de détection d'un stress oxydatif dans les embryons de poisson zèbre décrits ici comprend deux méthodes différentes. L'ensemble de la méthode de montage ROS-détection est principalement un dosage qualitatif pour ROS-détection, tandis que la méthode de détection de ROS cellulaire unique permet des mesures quantitatives plus précises (figure 1). Les deux méthodes offrent un moyen rapide et facile d'évaluer in vivo ROS-…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hydrogen peroxide solution | SIGMA | 516813 | DO NOT STORE DILUITIONS |
| Hank's Balanced Salt Solution 1X | GIBCO | 14025 | |
| Methyl cellulose | SIGMA | M0387 | |
| Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture | INSTANT OCEAN | SS15-10 | |
| Tricaine | SIGMA | A5040 | |
| Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent | INVITROGEN | C10422 | |
| Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX | INVITROGEN | M36008 | dissolve one vial with 13μl of DMSO |
| Hydroethidine | INVITROGEN | D23107 | |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Prepare 5mM stock solution in DMSO. |
| Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
| VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine | EnzoLifeScience | BML-EI395 | dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water |
| Propidium Iodide | Molecular probes (Life Technologies) | P3566 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | Molecular probes (Life Technologies) | A1310 | |
| Nrf2a Morpholino | GeneTools | 5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3' | Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 ) |
| Collagenase P | ROCHE | 11213857001 | Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO | 10010-056 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082-147 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | ROCHE | Dissolve one tablet in 1ml of water | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red | GIBCO | 15400-054 | Prepare 1X working solution before usage |
| Compound microscope | ZEISS | ||
| Stereo microscope with fluorescent illumination | Nikon | AZ100 | |
| camera | ZEISS | AxioCamMRm | |
| software for fluorescence image acquisition | ZEISS | ZEN 2011 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| FACS tubes | BD | 342065 | |
| Multiwell Plate | BD Falcon | 353047 | |
| Sterilized, non treated Petri dishes 90mm | VWR | 391-1915 | |
| Confocal microscope | Leica | Leica SP5 |
Referenzen
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
- Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
- Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease–an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
- Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
- Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
- Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles’ heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
- Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
- Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
- Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
- Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
- Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
- Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
- Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
- Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
- Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
- Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
- Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
- Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
- Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
- Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
- Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
- Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
- Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
- Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
- Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
- Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
- Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
- Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
- Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
- Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
- Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
- Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
- Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
- Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
- Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
- Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
- Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
- Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
- Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
- Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
- Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
- Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).
