Анализ окислительного стресса у эмбрионов данио рерио
Summary
Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.
Abstract
Высокие уровни активных форм кислорода (АФК) может вызвать изменение состояния сотовой окислительно-восстановительного к окислительному состоянии стресса. Эта ситуация вызывает окисление молекул (липидов, ДНК, белков) и приводит к гибели клеток. Окислительный стресс также влияет на прогрессирование нескольких патологических состояний, таких как диабет, ретинопатия, нейродегенеративные и рак. Таким образом, важно определить инструменты для исследования окислительных условиях стресса не только на уровне одиночных клеток, но также в контексте целых организмов. Здесь мы рассмотрим данио эмбриона в качестве полезного в системе естественных условиях для выполнения таких исследований и приводим протокол для измерения в естественных условиях окислительного стресса. Воспользовавшись люминесцентных АФК зондов и рыбок данио трансгенных флуоресцентных линий мы разрабатываем два различных метода для измерения окислительного стресса в естественных условиях: I) "Весь эмбрион метод РОС-обнаружение" для качественного измерения окислительного стресса и б) А "одноклеточных РОС метод обнаружения "для количественных измерений окислительного стресса. В данном случае мы демонстрируют эффективность этих процедур, увеличивая окислительный стресс в тканях путем окислительных агентов и физиологических или генетических методов. Этот протокол является поддаются для форвардных генетических экранов, и это поможет адрес причинно-следственных связей АФК на животных моделях окислительного стресса, связанных патологий, таких как неврологические расстройства и рак.
Introduction
Окислительный стресс специально определяется как состояние, что результаты от неуравновешенное состояние сотовой окислительно-восстановительной. Сложные окислительно-восстановительные реакции, которые обычно происходят в клетках определения клеточной редокс-состояние. Окислительно-восстановительные реакции состоит из всех химических реакций, которые состоят в передаче электронов между атомами биологических молекул, производящих восстановление и окисление молекул (то есть окислительно-восстановительных реакций). Эти реакции катализируется электронном активированных видов (т.е. про-окислительные видов), которые характеризуются крайней структурной неустойчивости и спонтанной активации неуравновешенных электронов, которые обмениваются с соседними биомолекул. Эти неправильные реакции приводят в повреждении ДНК, белка карбоксилирования, и окисление липидов, и в конечном итоге привести к гибели клеток 1. Повышенные уровни оксидативного стресса были связаны со старением и прогрессировании различных патологических состояний 2. Окислительный стресс имеетСообщалось, что ответственность за сосудистых изменений в диабет и сердечно-сосудистых заболеваний 3,4. Он также играет важную роль в дегенерации нейронов при болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона 5. Кроме того, окислительный стресс была продемонстрирована в качестве важнейшего фактора в управлении прогрессирование рака и метастатических события 6,7. Кроме того, воспаление и иммунный ответ может вызвать и дальнейшее сопровождение окислительный стресс 8.
В живых клетках, про-окислительные видов являются производными от кислорода (ROS; активных форм кислорода) или азота (RNS; видов активного азота). ROS включают гидроксильный радикал, в супероксид-анион (OH). (O 2 -) и перекись водорода (H 2 O 2). Первичный RNS является закись азота (NO.). Ряд вторичных активных форм могут быть получены путем взаимодействия спонтанных betweeн АФК и RNS или свободных металлов ионов 9. Например, супероксид-анион реагирует с закисью азота с образованием пероксинитрат (ONOO -), в то время как H 2 O 2 в реакцию с Fe 2 + генерирует гидроксильные радикалы. АФК и RNS, из-за их способности реагировать с несколько биомолекул, считаются опасной угрозой для поддержания физиологического состояния окислительно-восстановительного 10. Чтобы поддерживать окислительно-восстановительное состояние клетки снабжены серией детоксикации молекул антиоксидантными и ферменты. Супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы и Пероксиредоксины существу составляют антиоксидантным ферментативную-арсенал, который обеспечивает сотовой защиты от про-окислительных видов в том числе H 2 O 2, ОН и Oono -. 11. Также молекулы антиоксиданта, как витамин С и Е, полифенолы и CoenzymeQ10 (коэнзима Q10) имеют решающее значение для утоления ROS и их опасного деrivatives 12,13. Однако избыточное производство АФК и RNS, или дисфункции в системе Антиоксидант, сдвигает клеточный редокс-состояние к окислительному стрессу 14.
Кроме того, их негативный оттенок, ROS могут играть различные физиологические роли в клетках различного происхождения. Клетки обычно производят ROS как сигнальные молекулы в качестве посредника нормальные биологические события, такие как хост-защиту и заживления ран 15-17. Активные формы обычно получают в клетках путем внутриклеточных ферментов, таких как NOx (НАДФН-оксидазы) и XO (ксантина оксидазы) в ответ на сигнальных факторов, факторов роста и внутриклеточных колебаний уровней кальция 18,19. Было сообщено, что ROS может дифференциально модулировать активность важных ядерных факторов, таких как p53 или клеточных компонентов, таких как ATM-киназы, мастер регулятора ответ на повреждение ДНК 20. Аналогично АФК сильно влияют сотовой сигнализации на посредничество тыс.э окисления и инактивация белка тирозина фосфатазы (PTPs), которые устанавливаются в качестве важнейших регуляторов передачи сигнала 21. Кроме того, протеомные основе методологии продемонстрировать, что RNS также несут ответственность за конкретные изменения белковых и изменений молекулярной сигнализации. RNS реагировать с цистеином тиоловых групп модифицирующих их в S-nitrothiols (SNO) и молекулярных путей, вызывающих одновременно с патологических состояний, таких как воспалительных и аутоиммунных заболеваний 22,23.
Поскольку культура клеток эксперименты лишь частично воспроизвести множество факторов, действующих в естественных условиях, это представляет большой интерес для выполнения окислительно-восстановительные исследования на животных моделях 24,25. Чтобы достичь этого, данио рерио был рассмотрен подходит позвоночных животной модели для исследования динамики окислительные стресс 26. Данио это новая модель системы, которая предоставляет ряд преимуществ для изучения клеточных и генетических событий во позвоночных разработчикаelopment и болезни. Большие кластеры эмбрионов могут быть получены и доступны в неделю в течение эксперимента потребностей. Кроме того, внеочередное оптическая прозрачность из эмбрионов данио рерио, а также их небольшой размер, позволяет один визуализации клеток и динамический трекинг в целом организмов 27. В последнее десятилетие, значительное число рыбок данио мутантов были получены для моделирования человеческих патологических состояний, таких как рак и генетические заболевания 28-31. Самое главное, множество трансгенных линий был произведен, чтобы позволить широкие возможности генетических и биологических манипуляций 32. Например, трансгенные тканеспецифические данио линии регулярно используются для естественных условиях исследования в. Эти строки выражают флуоресцентный белок под контролем выбранного промоутер, предлагая возможность идентифицировать отдельные клетки в естественных условиях, а также анатомическое строение они составляют.
Несколько токсикологические исследования уже используются тон данио рерио, чтобы оценить эффект в естественных условиях на окислительно-восстановительного гомеостаза химических веществ, что свидетельствует о пригодности этой позвоночных как животной модели для области лекарственных препаратов и окислительного стресса 33-35. Хотя некоторые флуоресцентные зонды были протестированы для мониторинга окислительного стресса у рыбок данио личинки 36,37, нет никаких установленных анализы для обнаружения и измерения уровня оксидативного стресса у рыбок данио тканей и живые клетки. Здесь мы опишем процедуру количественного в естественных условиях окислительного стресса в живых клетках эмбрионов данио рерио. Обработки изображений инструменты, СУИМ сортировка, флуоресцентные зонды и про-окислительные условия все объединены для создания простого анализа для обнаружения и количественного определения окислительных видов у эмбрионов рыбок данио и тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги
Порядок окислительного обнаружении напряжения у эмбрионов рыбок данио, описанных здесь, включает в себя два различных метода. Весь метод крепления РОС-обнаружения в основном качественный анализ для РОС-обнаружения, а метод РОС-обнаружение одной клетки …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hydrogen peroxide solution | SIGMA | 516813 | DO NOT STORE DILUITIONS |
| Hank's Balanced Salt Solution 1X | GIBCO | 14025 | |
| Methyl cellulose | SIGMA | M0387 | |
| Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture | INSTANT OCEAN | SS15-10 | |
| Tricaine | SIGMA | A5040 | |
| Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent | INVITROGEN | C10422 | |
| Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX | INVITROGEN | M36008 | dissolve one vial with 13μl of DMSO |
| Hydroethidine | INVITROGEN | D23107 | |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Prepare 5mM stock solution in DMSO. |
| Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
| VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine | EnzoLifeScience | BML-EI395 | dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water |
| Propidium Iodide | Molecular probes (Life Technologies) | P3566 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | Molecular probes (Life Technologies) | A1310 | |
| Nrf2a Morpholino | GeneTools | 5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3' | Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 ) |
| Collagenase P | ROCHE | 11213857001 | Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO | 10010-056 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082-147 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | ROCHE | Dissolve one tablet in 1ml of water | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red | GIBCO | 15400-054 | Prepare 1X working solution before usage |
| Compound microscope | ZEISS | ||
| Stereo microscope with fluorescent illumination | Nikon | AZ100 | |
| camera | ZEISS | AxioCamMRm | |
| software for fluorescence image acquisition | ZEISS | ZEN 2011 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| FACS tubes | BD | 342065 | |
| Multiwell Plate | BD Falcon | 353047 | |
| Sterilized, non treated Petri dishes 90mm | VWR | 391-1915 | |
| Confocal microscope | Leica | Leica SP5 |
Referenzen
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
- Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
- Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease–an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
- Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
- Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
- Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles’ heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
- Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
- Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
- Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
- Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
- Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
- Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
- Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
- Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
- Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
- Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
- Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
- Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
- Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
- Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
- Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
- Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
- Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
- Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
- Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
- Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
- Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
- Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
- Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
- Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
- Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
- Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
- Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
- Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
- Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
- Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
- Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
- Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
- Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
- Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
- Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
- Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).
