제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석
Summary
Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.
Abstract
반응성 산소 종 (ROS)의 높은 수준은 산화 적 스트레스 조건을 향한 세포의 산화 환원 상태의 변화를 유발할 수있다. 이 상황은 분자 (지질, DNA, 단백질)의 산화를 일으키는 원인이되고 세포 죽음에 이르게한다. 산화 스트레스도 영향 당뇨병, 망막 병증, 신경 변성, 암 등 여러 가지 병적 인 상태의 진행. 따라서, 단일 세포 수준에서뿐만 아니라 전체 유기체의 맥락에서뿐만 아니라, 산화 적 스트레스 조건을 조사 할 수있는 도구를 정의하는 것이 중요하다. 여기에서, 우리는 연구를 수행하고 생체 내 산화 스트레스를 측정 할 수있는 프로토콜을 제공하는 생체 시스템의 유용한 제브라 피쉬 배아를 고려합니다. "나는) 산화 스트레스의 질적 측정을 위해"전체 배아 ROS-검출 방법 "및 II) : 형광 ROS 프로브 및 제브라 피쉬의 형질 전환 형광 라인을 활용, 우리는 생체 내에서 산화 스트레스를 측정하는 두 가지 방법을 개발산화 스트레스의 정량적 측정을위한 단일 셀 ROS 검출 방법 ". 여기서, 우리는 산화제 에이전트 및 생리 학적 또는 유전 적 방법으로 조직의 산화 스트레스를 증가시켜 이러한 절차의 효과를 보여줍니다. 이 프로토콜은 앞으로 유전자 스크린에 대한 의무이며 이러한 신경 장애 및 암과 같은 산화 스트레스 관련 병리의 동물 모델에서 ROS의 주소 원인 – 결과 관계를하는 데 도움이됩니다.
Introduction
산화 스트레스는 특별히 불평형 세포 산화 환원 상태로부터 발생 조건으로 정의된다. 일상적으로 세포 내부에서 발생하는 복잡한 산화 환원 반응은 세포의 산화 환원 상태를 결정합니다. 산화 환원 반응 감소와 분자 (즉, 산화 환원 반응)의 산화를 생산하는 생체 분자의 원자 사이의 전자의 이동에 구성되어있는 모든 화학 반응으로 구성되어 있습니다. 이러한 반응은 극단적 인 구조 불안정과 이웃 생체 분자와 교환 불균형 전자의 자발적인 활성화를 특징으로 전자 활성 종 (즉, 프로 산화 종)에 의해 촉매된다. 이러한 불규칙한 반응은 DNA 손상, 단백질의 카르 복 실화, 지질의 산화로 발생, 결국 세포의 죽음 1로 이어집니다. 산화 스트레스의 증가 수준은 노화와 다른 병적 인 상태 2의 진행과 관련이있다. 산화 스트레스가당뇨병과 심혈관 질환 3,4 혈관 변경에 대한 책임을 져야하는 것으로보고되었습니다. 또한 알츠하이머 병에서 신경 변성에 중요한 역할을하고 파킨슨 병 5. 또한, 산화 스트레스는 암 진행 및 전이성 이벤트 6,7 지배하는 중요한 인자로 입증되었다. 또한, 염증과 면역 반응이 유도 및 추가 지원의 산화 스트레스 8있다.
또는 질소 (RNS, 반응성 질소 종), 살아있는 세포에서 프로 산화 종은 산소 (활성 산소 종 ROS)에서 파생됩니다. (H 2 O 2), 및 과산화수소 – (O 2) ROS는 수퍼 옥사이드 음이온, (. OH) 히드 록실 라디칼을 포함한다. 기본 RNS는 아산화 질소 (NO.)입니다. 이차 반응 종의 일련 betwee 자발적인 상호 작용에 의해 발생 될 수있다N ROS와 RNS 또는 무료 금속은 9 이온. H 2 O 2가 철 2 + 하이드 록실 라디칼을 발생과 반응하면서, – 예를 들면, 수퍼 옥사이드 음이온 peroxynitrate (ONOO)을 형성하는 질소 산화물과 반응한다. ROS와 RNS 인해 여러 가지 생체 분자와 반응 할 수있는 능력으로, 생리적 인 산화 환원 상태 (10)의 유지 보수를 위해 위험한 위협으로 간주됩니다. 유지하기 위해 산화 환원 상태의 세포는 산화를 억제하는 분자와 효소를 해독하는 일련의를 갖추고 있습니다. . 11 – 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 (SOD)는, 카탈라제, 글루타티온 과산화 효소 및 Peroxiredoxins는 기본적으로 H 2 O 2, OH와 오노 등의 프로 산화 종의 세포 보호 기능을 제공하는 항산화 효소 – 아스날을 구성한다. 또한 비타민 C와 E, 폴리 페놀 및 보효소 Q10 (코큐텐)과 같은 항산화 분자는 ROS와 그 위험한 데를 해소하기 위해 매우 중요합니다12, 13 rivatives. 그러나, ROS 및 RNS 또는 항산화 제 시스템 장애의 과잉 생산은 산화 적 스트레스 (14)를 향해 세포 산화 환원 상태를 시프트.
부정적인 의미 외에, ROS는 서로 다른 기원의 세포에서 다양한 생리 학적 역할을 할 수있다. 세포는 일반적으로 같은 숙주 방어와 상처 수리 15-17 정상적인 생물학적 이벤트를 중재하는 분자 신호로 ROS를 생산하고 있습니다. 반응 종은 일반적으로 신호 인자, 성장 인자, 칼슘 레벨 (18, 19)의 세포 내 변동에 대한 응답 등의 NOX (NADPH 산화 효소)와 XO (Xantine 산화 효소)와 같은 세포 내 효소에 의해 세포에서 생성된다. 이것은 ROS가 p53의 그러한 차별적 또는 ATM-키나아제, DNA 손상 반응 (20)의 마스터 레귤레이터 같은 세포 성분으로서 중요한 핵 인자의 활성을 조절 할 수 있다고보고되었다. 유사하게 ROS는 강력하게 일을 매개로 세포 신호 전달에 영향을 미치는전자의 산화 및 신호 전달 (21)의 중요 규제로 설립되는 단백질 티로신 포스파타제 (PTPS)의 불 활성화. 또한, 단백질 체학 기반 방법론은 RNS는 특정 단백질의 수정 및 분자 신호의 변경에 대한 책임이 있음을 보여줍니다. RNS는 S-nitrothiols (SNO)에이를 수정하고 염증 및자가 면역 질환 (22, 23) 등의 병적 상태와 수반하는 분자 경로를 트리거 시스테인 티올 그룹과 반응한다.
세포 배양 실험은 단지 부분적으로 생체 내에서 작용하는 요인 중 다수를 재현하기 때문에, 동물 모델 (24, 25)에 산화 환원 연구를 수행하기 위해 큰 관심이다. 이를 위해 제브라 피쉬는 산화 스트레스 역학 26 공부 적합한 척추 동물 모델로 간주되었다. 제브라 피쉬는 여러 가지 장점이 척추 데브 동안 세포 및 유전 이벤트를 연구하기 위해 부여하는 새 모델 시스템입니다elopment과 질병. 배아의 큰 클러스터는 실험의 요구에 매주 생성 및 사용할 수 있습니다. 또한 제브라 피쉬 배아의 특별한 광학 선명도뿐만 아니라 작은 크기는 전체 생물 27 단일 세포 이미징 및 동적 추적을 할 수 있습니다. 지난 10 년, 제브라 피쉬 돌연변이의 상당수는 암과 유전 질환 28 ~ 31으로 인간의 병적 인 조건을 모델로 생성 된. 가장 중요한 것은, 유전자 변형 라인의 다수는 유전과 생물학적 조작 (32)의 폭 넓은 기회를 제공 할 수 있도록 제작되었습니다. 예를 들어, 유전자 조직 특정 제브라 피쉬 라인은 정기적으로 생체 내 연구에 이용된다. 이 라인은 생체 내에서 단일 세포를 식별 할 수있는 능력뿐만 아니라, 그들이 포함 해부 구조를 제공 선택된 프로모터의 제어하에 형광 단백질을 발현.
여러 독성 연구는 이미 T를 사용했습니다그는 약물 발견 및 산화 스트레스 33-35의 분야에 대한 동물 모델 등이 척추의 적합성을 제안, 산화 환원 항상성에 화학 물질의 생체 내 효과를 평가하기 위해 제브라 피쉬. 약간의 형광 프로브는 제브라 피쉬의 유충 (36, 37)에 산화 스트레스를 모니터링하기 위해 테스트되었습니다 경우에도, 제브라 피쉬의 조직에서 산화 스트레스의 수준과 살아있는 세포를 감지하고 측정 할 수있는 확립 된 시험 법이 없습니다. 여기에서 우리는 제브라 피쉬 배아의 살아있는 세포에 산화 스트레스의 생체 정량화하기위한 절차를 설명합니다. 이미징 도구, FACS 정렬, 형광 프로브 및 프로 산화 조건은 모든 제브라 피쉬 배아 조직에서 검출 및 산화 종의 정량화에 대한 간단한 분석을 생성하기 위해 결합됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
중요한 단계
본원에 기재된 제브라 피쉬 배아 산화 스트레스 탐지하는 절차는 두 가지 다른 방법을 포함한다. 단일 셀 ROS 검출 방법 (도 1)보다 구체적인 정량적 측정을 허용하는 동안 전체 마운트 ROS 검출 방법은 주로 ROS 검출을위한 정성 분석이다. 두 가지 방법은 제브라 피쉬 배아에 생체 활성 산소 검출을 평가하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다. 그러?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hydrogen peroxide solution | SIGMA | 516813 | DO NOT STORE DILUITIONS |
| Hank's Balanced Salt Solution 1X | GIBCO | 14025 | |
| Methyl cellulose | SIGMA | M0387 | |
| Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture | INSTANT OCEAN | SS15-10 | |
| Tricaine | SIGMA | A5040 | |
| Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent | INVITROGEN | C10422 | |
| Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX | INVITROGEN | M36008 | dissolve one vial with 13μl of DMSO |
| Hydroethidine | INVITROGEN | D23107 | |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Prepare 5mM stock solution in DMSO. |
| Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
| VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine | EnzoLifeScience | BML-EI395 | dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water |
| Propidium Iodide | Molecular probes (Life Technologies) | P3566 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | Molecular probes (Life Technologies) | A1310 | |
| Nrf2a Morpholino | GeneTools | 5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3' | Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 ) |
| Collagenase P | ROCHE | 11213857001 | Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO | 10010-056 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082-147 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | ROCHE | Dissolve one tablet in 1ml of water | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red | GIBCO | 15400-054 | Prepare 1X working solution before usage |
| Compound microscope | ZEISS | ||
| Stereo microscope with fluorescent illumination | Nikon | AZ100 | |
| camera | ZEISS | AxioCamMRm | |
| software for fluorescence image acquisition | ZEISS | ZEN 2011 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| FACS tubes | BD | 342065 | |
| Multiwell Plate | BD Falcon | 353047 | |
| Sterilized, non treated Petri dishes 90mm | VWR | 391-1915 | |
| Confocal microscope | Leica | Leica SP5 |
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