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Biologie

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

Published: July 07, 2014
doi:
10.3791/51328
, ,
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science,University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology,Vesalius Research Center, VIB

Summary

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Abstract

Altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) pode causar uma mudança de estado redox celular para condição de estresse oxidativo. Esta situação faz com que a oxidação de moléculas de lípidos (, ADN, proteína), e leva à morte das células. O estresse oxidativo também afeta a progressão de várias condições patológicas como diabetes, retinopatias, neurodegeneração e câncer. Assim, é importante definir ferramentas para investigar condições de stress oxidativo, não só ao nível das células individuais, mas também no contexto de todo o organismo. Aqui, consideramos o embrião zebrafish como um útil no sistema vivo para realizar estudos e apresentar um protocolo para medir in vivo do estresse oxidativo. Aproveitando fluorescentes sondas ROS e linhas fluorescentes transgênicos zebrafish, desenvolvemos dois métodos diferentes para medir o estresse oxidativo in vivo: i) um "método de detecção de ROS todo embrião" para a medida qualitativa do estresse oxidativo e ii) um "unicelular método de detecção de ROS "para medições quantitativas de estresse oxidativo. Aqui, nós demonstramos a eficácia desses procedimentos, aumentando o estresse oxidativo nos tecidos por agentes oxidantes e métodos fisiológicos ou genéticos. Este protocolo é favorável para telas genéticos para a frente e vai ajudar as relações de causa-efeito endereço de ROS em modelos animais de patologias relacionadas ao estresse oxidativo, tais como doenças neurológicas e câncer.

Introduction

O estresse oxidativo é especificamente definida como uma condição que resulta de um estado redox celular desequilibrado. As reações redox complexas que rotineiramente ocorrem no interior das células determinar o estado redox celular. Reacções redox constituído por todas as reacções químicas que consistem na transferência de electrões entre os átomos das moléculas biológicas que produzem redução e oxidação de moléculas (por exemplo, reacções redox). Estas reacções são catalisadas por espécie activada electronicamente (por exemplo, espécies de pró-oxidantes), que são caracterizadas por uma instabilidade estrutural extrema e a activação espontânea de electrões desequilibradas que trocam com biomoléculas vizinhos. Estas reacções irregulares resultar em danos no DNA, carboxilação de proteínas e oxidação lipídica e, eventualmente, levar à morte celular 1. Aumento dos níveis de stress oxidativo têm sido associados com o envelhecimento e a progressão de diversos estados patológicos 2. O estresse oxidativo temfoi relatado para ser responsável por alterações vasculares em diabetes e doenças cardiovasculares 3,4. Também desempenha um papel crítico na degeneração neuronal na doença de Alzheimer e doença de Parkinson 5. Além disso, o estresse oxidativo tem sido demonstrada como um fator crítico para governar a progressão do câncer e eventos metastáticos 6,7. Além disso, as respostas imunes e inflamação pode provocar estresse e mais apoio oxidativo 8.

Em células vivas, espécies pró-oxidantes são derivados de oxigênio (ROS, espécies reativas de oxigênio) ou de nitrogênio (RNS; espécies reativas de nitrogênio). ROS incluem o radical hidroxilo, anião de superóxido (OH.) (O 2 -), e o peróxido de hidrogénio (H 2 O 2). O primário RNS é o óxido nitroso (NO.). Uma série de espécies reactivas secundárias podem ser gerados por interacções espontâneas between ROS e RNS ou metais livres íons 9. Por exemplo, o anião superóxido reage com o óxido nitroso para formar peroxinitrato (ONOO -), enquanto H 2 O 2 a reagir com Fe 2 + gera radicais hidroxilo. ROS e RNS, devido à sua capacidade de reagir com várias biomoléculas, são consideradas uma grave ameaça para a manutenção do estado redox fisiológica 10. Para manter as células do estado redox estão equipadas com uma série de desintoxicar moléculas anti-oxidantes e enzimas. A superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase e Peroxirredoxinas constituem o essencial do anti-oxidante enzimático-arsenal que fornece proteção celular de espécies pró-oxidantes, incluindo H 2 O 2, OH e OONO -. 11. Também moléculas anti-oxidantes como a vitamina C e E, polifenóis e CoenzymeQ10 (CoQ10) são de importância crítica para saciar ROS e sua perigosa deusa derivativos 12,13. No entanto, uma produção excessiva de ROS e RNS, ou uma disfunção no sistema anti-oxidante, muda o estado redox celular para o estresse oxidativo 14.

Além de sua conotação negativa, ROS pode desempenhar várias funções fisiológicas em células de origem diferente. As células normalmente produzem ROS como moléculas sinalizadoras para mediar eventos biológicos normais, tais como a defesa do hospedeiro e reparação de feridas 15-17. Espécies reactivos são normalmente produzidas em células por enzimas intracelulares, tais como NOX (NADPH oxidase) e XO (xantina oxidase), em resposta a factores de sinalização, factores de crescimento, e as flutuações de níveis de cálcio intracelulares 18,19. Tem sido relatado que as ROS pode diferencialmente modular a actividade dos factores nucleares importantes, tais como p53 ou componentes celulares, tais como a ATM-quinase, um regulador do mestre de a resposta ao dano no DNA de 20. Analogamente ROS influenciar fortemente a sinalização celular através da mediação the oxidação e inactivação da proteína tirosina fosfatases (DPT), os quais são estabelecidos como reguladores críticos de transdução de sinal 21. Além disso, as metodologias proteômicas baseadas demonstrar que RNS também são responsáveis ​​por modificações e alterações de sinalização molecular de proteínas específicas. RNS reagem com os grupos tiol de cisteína modificados los em S-nitrothiols (SNO) e provocando vias moleculares concomitantes com os estados patológicos tais como doenças inflamatórias e auto-imunes 22,23.

Desde experimentos de cultura de células se reproduzem apenas parcialmente a multiplicidade de factores que actuam in vivo, é de grande interesse para realizar estudos de redox em modelos animais 24,25. Para conseguir isso, o peixe-zebra foi considerada um modelo animal vertebrado adequado para estudar a dinâmica de estresse oxidativo 26. O peixe-zebra é um novo modelo de sistema que concede várias vantagens para estudar eventos celulares e genéticas durante vertebrados devolvimento e doenças. Grandes aglomerados de embriões pode ser gerada e está disponível semanal para as necessidades experimentais. Além disso, a claridade óptica extraordinária de embriões de peixes-zebra, bem como o seu tamanho pequeno, permite que imagens de células única e rastreio dinâmico em organismos inteiro 27. Na última década, um número considerável de mutantes peixe-zebra foram gerados para modelar condições patológicas humanas, como câncer e doenças genéticas 28-31. Mais importante ainda, uma infinidade de linhagens transgênicas foi produzido para permitir grandes oportunidades de manipulações genéticas e biológicas 32. Por exemplo, linhas de peixes-zebra transgénicos específicos de tecido são regularmente utilizados para estudos in vivo. Estas linhas de expressar uma proteína fluorescente, sob o controlo de um promotor seleccionado, oferecendo a possibilidade de identificar uma única célula in vivo, bem como com a estrutura anatómica eles compreendem.

Vários estudos toxicológicos já usou tele peixe-zebra para avaliar o efeito in vivo de produtos químicos na homeostase redox, sugerindo a adequação deste vertebrado como um modelo animal para o campo da descoberta de drogas e de stress oxidativo 33-35. Mesmo que algumas sondas fluorescentes foram testados para monitorar o estresse oxidativo em larvas do peixe 36,37, não há ensaios estabelecidos para detectar e medir os níveis de estresse oxidativo nos tecidos de peixes-zebra e células vivas. Aqui nós descrevemos um procedimento para a quantificação in vivo do estresse oxidativo em células de embriões de peixes-zebra viva. Ferramentas de imagem, separação FACS, sondas fluorescentes e condições pró-oxidantes são combinados para gerar um ensaio simples para a detecção e quantificação de espécies oxidativas em embriões de peixe-zebra e tecidos.

Protocol

1. Preparação de instrumentos e soluções de trabalho Preparar a solução de água de peixe. Faça uma solução estoque, dissolvendo 2 g de "Instant Ocean 'sais do mar em 50 ml de água destilada. Adicionar 1,5 ml de caldo de peixe de água para 1 L de água destilada para preparar pronto para usar água de peixe (sais do mar de 60 mcg / mL concentração final). Autoclave o pronto para usar água de peixe antes do uso. Esta solução é utilizada como meio de embriões de peixe-zebra. …

Representative Results

Ao aplicar o método aqui descrito, podemos facilmente medir e detectar o estresse oxidativo (e níveis de ROS) em tecidos embrionários peixe-zebra. Depois de atravessar adulto zebrafish, os ovos são coletados e autorizados a desenvolver a 28 ° C a 72 horas pós-fecundação (hpf). Para induzir o estresse oxidativo, propomos duas abordagens diferentes: 1) o tratamento de embriões com fortes reagentes pró-oxidantes ou 2) promover a formação de ROS após a lesão de tecidos. Na primeira…

Discussion

Etapas críticas

O procedimento para a detecção de stress oxidativo em embriões de peixe-zebra aqui descritos compreende dois métodos diferentes. O método de detecção de ROS montagem inteira é principalmente um teste qualitativo para a detecção de ROS, enquanto a célula único método de detecção de ROS permite medições quantitativas mais específicas (Figura 1). Ambos os métodos oferecem uma maneira rápida e fácil de avaliar a detecção de ROS-in vivo</…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1X GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe:                              CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes       (Life Technologies)  P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes         (Life Technologies)  A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3' Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1X working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
camera  ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5
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Diesen Artikel zitieren
Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).
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