比色纸为基础的检测<em>大肠杆菌</em><em>沙门氏菌</em>属，和<em>单核细胞增生李斯特氏菌</em>从农业用水大容量
Summary
A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.
Abstract
本协议描述快速比色检测农产品水域的大肠杆菌 ， 沙门氏菌和李斯特菌的大量（10升）。这里，水通过无菌改性摩尔棉签（MMS），它由装在一个塑料盒的简单纱布过滤器的过滤，浓缩的细菌。过滤后，非选择性或选择性富集的靶细菌在MMS中进行。对于比色法检测目标细菌的富集，然后用纸张为基础的嵌入式细菌指示基板分析设备（μPADs）测定。每个基片会与目标指示细菌的酶，产生可以目视（定性检测）上μPAD来检测有色产物。可替换地，可以使用公共扫描或摄影装置生成并使用ImageJ软件，人分析了反应μPADs的数字图像仰角调整器的结果更加客观和标准化的解释。尽管生化筛查程序的设计，以确定上述的细菌病原体，在某些情况下背景微生物或比色底物的降解酶的产生可能会产生假阳性。因此，需要确认使用的是更多的歧视诊断。然而，这种细菌浓度和检测平台价格低廉，敏感（0.1 CFU / ml的检测限），易于操作，快速的（是在大约24小时进行浓缩，富集和检测），其理由作为初步筛选的使用方法对农业用水的微生物质量。
Introduction
重要的是，食源性疾病代理人，以减少食源性疾病的负担迅速，最好在检测场为基础的环境。共同战略，以检测食源性致病菌包括生化分析，选择性和鉴别培养，免疫隔离和检测和分子检测。然而，这些方法是由零星污染的阻碍，测试样本量小，则往往低浓度的食源性致病菌，需要很长的处理时间，和/或不适用于字段设置。此外，在许多食物基质的化合物是抑制到检测和诊断应用。为了提高微生物检测的可能性，美国食品和药物管理局已提出，测试农业用水（如洗涤用水和灌溉用水），其中任一接触到新鲜产品有很大的表面积接触或用作车辆对produce污染是一个可行的替代食品1的直接测试。即便如此，往往低自然病原体负担再加上代表性的农业水样的稀释作用使样品制备方法的病原体浓度至关重要。这种方法将需要采样大量的水（≥10 L），适当的病原体浓度，并与下游检测策略的兼容性。
修改摩尔拭子（MMS）是用于从浓缩水2-4大容量（≥10L）细菌便宜，简单，坚固耐用的设备。彩信由一个塑料盒填充用纱布，它作为一个粗过滤器，大体积的水，用蠕动泵通过盒泵入的。彩信是细菌浓度（≥10倍浓缩）的非歧视性的方法，捕捉有机和无机颗粒材料，包括在处理里的微生物镑样品。它很可能是由MMS靶微生物的浓度的优良功效可通过一个事实，即微生物预期将附着在粉砂质粘土组分或有机微聚集的悬浮物3进行说明。坚固耐用的设计，彩信允许克服与其它过滤方法捕获从水中细菌，如堵塞的过滤器，无法处理大量，过滤器样品浊度高，而且成本高和浓度有关的大多数缺点。由于这些原因，美国食品药品管理局的建议将彩信的纳入环境和生产相关的样品收集程序5官方程序。
这里，描述了一种方法用于浓缩，富集和检测大肠杆菌 ， 沙门氏菌 ， 单增李斯特菌来自农业的水域。彩信用于BACT的浓度ERIA，并且还用作用于选择性或非选择性富集细菌的容器。使用的纸张为基础的分析设备（μPADs）6达到细菌检测生化。 μPADs可以被制造为流体网络，或使用了多种方法，包括光刻法，喷墨印刷，压印，和蜡印7-11斑点试验。的流体设计的例子可以是其中样品被沉积在中间，并随后流入其中样品或基底被从通道的外储层被拉通过毛细作用进入中心12前端水库或单声道模式的树突状通道模式。对于这个协议，我们选择采用的嵌有显色底物7毫米直径的腊纸点阵列，可以通过指示在这里测试的微生物的酶进行处理：氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷（CPRG）和5 – 溴-4 – 氯-3 – 吲哚基β-D-葡糖苷酸（X-GLUC）用于检测β-半乳糖苷酶和β-葡糖苷酸酶由大肠杆菌产生大肠杆菌 ; 5 -溴-6 -氯-3 -吲哚辛酸盐（品红辛酸盐），用于由沙门菌属生产的C8-酯酶的检测;和5 -溴-4 -氯-3 -吲哚基- 肌醇 -磷酸（X-磷化铟），用于检测磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI-PLC）制作的L。菌等 6。因此，一个特定的细菌的存在下，可以目视观察，而不需要复杂的设备或数据的解释。的基于酶的比色μPAD检测这些特定的目标细菌的特异性和灵敏度先前已探索6。此外，对于这些靶细菌的集成浓度检测方法的灵敏度由尖峰的大体积的水的微生物（未发表数据和比沙等人 13）的预先确定的水平进行评价。
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议描述了用于检测大肠杆菌集成方法大肠杆菌 ， 沙门氏菌和L。菌在农业用水。这里，细菌从大量的农业用水MMS浓度（10升），被加上细菌富集，并使用μPADs细菌，指示比色检测。彩信程序可以应付水样中高颗粒含量而集中的细菌10倍，是强大和现场应用通过微创培训的人员足够简单，并且可以以最小的成本来完成。通过将细菌富集步骤，活细菌进行检测，该方法的…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.
Materials
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 × 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase- free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
Referenzen
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- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
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