Colorimetrico carta a base di rilevamento di<em> Escherichia coli</em>,<em> Salmonella</em> Spp., E<em> Listeria monocytogenes</em> Da grandi volumi di acqua agricolo
Summary
A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.
Abstract
Questo protocollo descrive rapida individuazione colorimetrica di Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes e dai grandi volumi (10 L) delle acque agricole. Qui, l'acqua viene filtrata attraverso sterile Modificati Moore Tamponi (MMS), che consistono in un semplice filtro di garza racchiuso in una cartuccia di plastica, per concentrare i batteri. Dopo filtraggio, arricchimenti non selettivi o selettivi per i batteri bersaglio sono eseguiti nel MMS. Per il rilevamento colorimetrico dei batteri bersaglio, i arricchimenti vengono poi analizzati utilizzando dispositivi analitici basati su carta (μPADs) integrati con batteri indicative substrati. Ogni substrato reagisce con enzimi batterici bersaglio-indicativo, generando prodotti colorati rilevabili visivamente (determinazione qualitativa) sul μPAD. In alternativa, le immagini digitali dei μPADs reagito possono essere generati con la scansione comune o dispositivi fotografici e analizzati utilizzando il software ImageJ, alsivo per l'interpretazione più oggettiva e standardizzata dei risultati. Sebbene le procedure di screening biochimici sono progettati per identificare i batteri patogeni di cui sopra, in alcuni casi enzimi prodotti da uno sfondo microbiota o la degradazione dei substrati colorimetrici può produrre un falso positivo. Pertanto, è necessaria una conferma tramite una diagnostica più discriminatorie. Tuttavia, questa concentrazione e rilevazione piattaforma batterica è poco costoso, sensibile (0,1 CFU / ml limite di rivelazione), facile da eseguire, e rapida (concentrazione, arricchimento, e la rilevazione viene effettuata entro circa 24 ore), giustificando il suo uso come metodo di screening iniziale per la qualità microbiologica dell'acqua agricola.
Introduction
E 'importante che gli agenti di malattie di origine alimentare vengono rilevati rapidamente e preferibilmente in contesti sul campo, al fine di ridurre l'onere delle malattie di origine alimentare. Strategie comuni per rilevare batteri patogeni di origine alimentare comprendono profili biochimici, coltura selettivo e differenziale, isolamento immunologica e rilevazione, e la diagnosi molecolare. Tuttavia, questi metodi sono ostacolati dalla sporadica contaminazione, campioni di piccole dimensioni testate, le basse concentrazioni spesso dei batteri patogeni di origine alimentare, richiedono tempi di lavorazione lunghi, e / o non sono applicabili per le impostazioni dei campi. Inoltre, composti in molte matrici alimentari inibiscono l'individuazione e applicazioni diagnostiche. Per migliorare la probabilità di rilevamento microbica, la Food and Drug Administration ha suggerito che il test acqua agricola (quali acqua acqua di lavaggio e irrigazione) delle quali viene a contatto con una grande superficie di prodotti freschi o serve come veicolo per pcontaminazione roduce è una valida alternativa alla sperimentazione diretta di prodotti alimentari 1. Anche così, la spesso bassa patogeno-carico naturale, accoppiato con l'effetto di diluizione del campione rappresentativo dell'acqua in agricoltura rende preparazione del campione metodi per la concentrazione di patogeni essenziale. Tale metodo richiederebbe campionamento grandi volumi di acqua (≥ 10 L), adeguata patogeno-concentrazione, e la compatibilità con le strategie di rilevamento a valle.
Tamponi Moore modificati (MMS) sono dispositivi a basso costo, semplici e robusti utilizzati per concentrare i batteri dai grandi volumi (≥ 10 L) di acqua 2-4. L'MMS è composto da una cassetta di plastica riempito di garza, che serve come un filtro grossolano per grandi volumi di acqua pompata attraverso il cassetto utilizzando una pompa peristaltica. L'MMS è un metodo non discriminatoria della concentrazione batterica (≥ concentrazione 10 volte) che cattura il materiale particolato organico e inorganico, tra cui i microrganismi in li trasformaticampioni di sterline. E 'probabile che l'eccellente efficacia di concentrazione di microrganismi bersaglio, entro il MMS può essere spiegato dal fatto che i microrganismi dovrebbero essere attaccato alla frazione limo-argilla o organici microaggregati dei solidi sospesi 3. Il design robusto di MMS consente di superare la maggior parte dei difetti associati con altri metodi di filtrazione per la cattura e la concentrazione dei batteri dall'acqua, come l'intasamento dei filtri, l'incapacità di elaborare grandi volumi, i campioni del filtro con elevata torbidità e costi elevati. Per questi motivi, la FDA raccomanda che MMS di essere incorporati nelle procedure ufficiali per le procedure di raccolta dei campioni ambientali e produrre correlati 5.
Qui, è descritto un metodo per la concentrazione, arricchimento, e la rilevazione di Escherichia coli, Salmonella spp., E Listeria monocytogenes dalle acque agricole. Un MMS è utilizzato per la concentrazione di bacteria, e serve anche come vaso per arricchimento batterica selettiva o non selettiva. Rilevazione batterica si ottiene biochimicamente utilizzando dispositivi analitici basati su carta (μPADs) 6. μPADs possono essere prodotte come reti fluidici o spot test utilizzando una varietà di metodi tra cui fotolitografia, la stampa a getto d'inchiostro, stampaggio, e la stampa a cera 7-11. Esempi di disegni fluidici possono essere modelli di canale dendritiche in cui il campione viene depositato al centro e successivamente flussi di serbatoi distali o modelli a singolo canale in cui il campione o substrato vengono tirati dai serbatoi esterni del canale per azione capillare verso il centro 12. Per questo protocollo, abbiamo scelto di utilizzare per 7 mm di diametro cera carta array loco incastonate con i substrati cromogeni che possono essere elaborati dagli enzimi indicativi dei microrganismi testati qui: Chlorophenol rosso β-D-galattopiranoside (CPRG) e 5 – bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glucuronide (X-Gluc)per il rilevamento di β-galattosidasi e β-glucuronidasi prodotta da E. coli; 5-bromo-6-cloro-3-indolil caprilato (magenta caprilato) per la rilevazione di C8-esterasi prodotta da Salmonella spp.; e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-myo-inositolo fosfato (X-InP) per il rilevamento di specifici fosfatidilinositolo-fosfolipasi C (PI-PLC) prodotto da L. monocytogenes 6. Pertanto, la presenza di un particolare batterio può essere osservato visivamente, senza la necessità di attrezzature complesse o l'interpretazione dei dati. La specificità e la sensibilità della rilevazione colorimetrica μPAD a base di enzimi di questi specifici batteri bersaglio è stato esplorato in precedenza 6. Inoltre, la sensibilità del metodo di concentrazione di rilevamento integrato per questi batteri bersaglio è stata valutata da chiodare di grandi volumi di acqua con livelli predeterminati di microrganismi (dati non pubblicati e Bisha et al. 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo integrato per rilevare E. coli, Salmonella spp., e L. monocytogenes in acqua agricoltura. Qui, la concentrazione di batteri MMS da grandi volumi (10 L) di acqua agricola, è accoppiato con l'arricchimento di batteri, e la rilevazione colorimetrica batterico-indicativo utilizzando μPADs. La procedura MMS può far fronte a elevato contenuto di particolato nei campioni di acqua concentrando la batteri 10 volte, è abbastanza robusto e semplice per applicazioni sul…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.
Materials
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 × 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase- free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
Referenzen
- . . Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
- Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
- McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
- . . Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).
- Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
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- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
- Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
- Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
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