Analyse automatisée de dynamique Ca<sup> 2 +</sup> Signaux de séquences d'images
Summary
Voici une nouvelle région d'intérêt protocole d'analyse basée sur le tri des ellipses meilleur ajustement attribués aux régions de signal positif dans le temps à deux dimensions image laps séquences est démontrée. Cet algorithme peut permettre aux enquêteurs d'analyser de manière approfondie les signaux physiologiques + Ca 2 avec entrée minimale de l'utilisateur et de partialité.
Abstract
Ca 2 + intracellulaire signaux sont couramment étudiées avec des colorants fluorescents de Ca2 + de l'indicateur et les techniques de microscopie. Cependant, l'analyse quantitative de Ca 2 + de données d'imagerie prend du temps et soumis à polarisation. Automatisés algorithmes d'analyse de signal selon la région d'intérêt (ROI) de détection ont été mises en œuvre pour les mesures de balayage de ligne unidimensionnelle, mais il n'y a pas de courant algorithme qui intègre l'identification optimisé et l'analyse de ROI dans des séquences d'images en deux dimensions. Voici un algorithme pour l'acquisition rapide et l'analyse de ROI dans des séquences d'images est décrit. Il utilise des ellipses correspondent aux signaux filtrés de bruit afin de déterminer le placement de ROI optimal, et calcule Ca 2 + paramètres de signal d'amplitude, la durée et la diffusion spatiale. Cet algorithme a été mis en œuvre comme un plug-in disponible gratuitement pour ImageJ (NIH) des logiciels. Avec son analyse écrites pour le open source logiciel de traitement statistique R,cette approche fournit un gazoduc à haute capacité pour l'analyse statistique rapide de la production expérimentale. Les auteurs suggèrent que l'utilisation de ce protocole d'analyse conduira à une caractérisation plus complète et impartiale de signalisation physiologique + Ca 2.
Introduction
Ca 2 + est un second messager ubiquitaire molécule de signalisation et de Ca 2 + cytosolique niveaux sont très réglementés. Ca 2 + intracellulaire signaux sont complexes et comprennent transitoires isolés, oscillations, et la propagation d'ondes 1 – 4. Contrôle spatial et temporel de Ca 2 + est pensé à la base physiologique spécificité du signal, et donc l'analyse de Ca 2 + modèles de signaux est d'un intérêt considérable pour les chercheurs dans de multiples domaines 5.
Colorants Ca 2 + d'indicateurs tels que le Fluo-4 et Fura-2 sont couramment utilisés pour mesurer Ca 2 + signaux intracellulaires avec la microscopie à fluorescence 5-12. Typiquement, Ca 2 + signaux temporels sont évalués comme des changements en fonction du temps de fluorescence moyenne dans une zone définie par l'utilisateur, ou de la région d'intérêt (ROI) 5,6,13 – 16. Actuellement, l'analyse manuelle de ROI est à la fois beaucoup de temps et de travail danstensive, car il oblige les utilisateurs à identifier de nombreux ROI et effectuer des calculs répétitifs 17-19. Ces techniques peuvent également faire l'objet d'une erreur d'utilisation considérable, y compris l'introduction de modes de signaux artificiels et l'exclusion de faible amplitude ou signaux diffus 18,20.
Des algorithmes de détection de ROI automatisés ont déjà été mises en œuvre en utilisant une variété de méthodes statistiques pour déterminer le placement de ROI optimal, mais ils ont généralement été limitée à l'analyse de balayage de ligne ou pseudo-ligne des images numérisées, ce qui limite l'analyse à une seule dimension spatiale dans le temps 17, 19-22. En outre, de nombreux algorithmes existants ne sont pas suffisants pour couvrir la diversité de Ca 2 + des événements de relâchement qui vont de périodiques, transitoires localisées à des ondes se propageant 23,24. Évaluation complète de Ca 2 + signaux physiologiques est souvent compliquée par la présence d'image significative artifLoi qui confond signal discrimination de bruit dans de nombreux systèmes expérimentaux.
Auparavant, une solution de l'algorithme de détection de ROI automatisé de Ca 2 + signal de détection de transitoires, mis en œuvre sous forme de plugin pour le logiciel NIH ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), a été développé et validé 25,26. Cet algorithme, appelé LC_Pro, a été conçu pour identifier et analyser ROI englobant Ca 2 + transitoires du signal en deux dimensions laps de temps des séquences d'images. Voici un protocole expérimental pratique et de démonstration représentant d'une application de l'algorithme dans porcine endothélium des artères coronaires est fourni, avec post-traitement supplémentaire utilisant l'open source logiciel de traitement statistique R pour générer une sortie graphique utilisable.
Protocol
Representative Results
Discussion
Décodage Ca 2 + signaux complexes au niveau cellulaire et multicellulaire nécessitera des approches expérimentales et analytiques rigoureux. Ici, une approche est décrite dans laquelle résolus séquences d'images confocale de Ca 2 + fluorescence dépendante sont soumis à une analyse automatisée qui identifie et quantifie Ca 2 + signaux statistiquement pertinentes dans les domaines cellulaires intactes Dans le cas spécifique présentés, un segment d'artère a été isolé…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé en partie par les Instituts nationaux de subventions à la santé HL-085887, HL-092992, S10RR027535, et MOP-93676.
Materials
| dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| imageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
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