동적 칼슘의 자동 분석<sup> 2 +</sup이미지 시퀀스에서> 신호

Summary

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca²⁺ signals with minimal user input and bias.

Abstract

세포 내 칼슘 ^{2 +} 신호는 일반적으로 형광 칼슘 ^{2 +} 지표 염료 및 현미경 기술을 연구한다. 그러나, 칼슘 ^{2 +} 영상 데이터의 정량 분석 시간과 바이어스에 따라 달라질 수 있습니다. 또한 (ROI)의 검출 영역에 기초하여 자동화 된 신호 분석 알고리즘은 일차원 라인 스캔 측정에 대해 구현되어 있지만 이차원 이미지 시퀀스에서 최적화 된 신분증과의 ROI 분석을 통합 전류 알고리즘은 없다. 여기서 이미지 시퀀스에서 수집 및 급속의 ROI 분석을위한 알고리즘을 설명한다. 이 타원이 최적의 투자 수익 (ROI)의 위치를 결정하기 위해 노이즈 필터링 된 신호에 맞게 활용하고, 진폭, 시간 및 공간 확산의 칼슘 ^{2 + 신호} 파라미터를 계산한다. 이 알고리즘은 ImageJ에 (NIH) 소프트웨어를 자유롭게 사용할 수 플러그인으로 구현되었습니다. 함께 오픈 소스 통계 처리 소프트웨어 R 용으로 작성된 분석 스크립트와,이러한 접근법은 실험 출력 퀵 통계 분석을 수행하기위한 고용량 파이프 라인을 제공한다. 저자는이 분석 프로토콜의 사용은 생리적 칼슘 ^{2 +} 신호의보다 완전하고 공정한 특성으로 이어질 것입니다 것이 좋습니다.

Introduction

칼슘 ^{2 +는} 분자 및 세포 내 칼슘 ^{2 +} 수준을 높게 조절되는 신호 유비쿼터스 두 번째 메신저입니다. 세포 내 칼슘 ^{2 +} 신호가 복잡하고 고립 과도, 진동, 파도 ¹ 전파 포함 ^{– 4.} 칼슘 ^{2 +의} 공간과 시간 제어 생체 신호 특이성을 기초로 생각, 따라서 칼슘 ^{2 +} 신호 패턴의 분석은 여러 필드 ^5의 조사에 상당한 관심입니다.

예컨대 플루오 (Fluo) -4의 Fura-2와 같은 칼슘 ^{2 +} 인디케이터 염료는 일반적으로 형광 현미경 ^5-12로 내 Ca ^{2 +} 신호를 측정하기 위해 사용된다. ^{16 –} 일반적으로, 시간적 칼슘 ^{2 +} 신호는 시간에 따른 사용자 정의 지역 내의 평균 형광의 변화, 또는 관심 영역 (ROI) ^5,6,13로 평가됩니다. 현재, 수동 ROI 분석은 시간과 노동력에^{19 -가} 많은 로아를 확인하고 반복적 인 연산 ^17을 수행하는 사용자가 필요로하기 때문에 긴장의. 이 기술은 인공 신호 모드와 낮은 진폭 또는 확산 신호 ^{(18, 20)의} 배제의 도입을 포함, 많은 사용자의 오차가있을 수 있습니다.

^, 자동 ROI 검출 알고리즘은 이전에 최적의 투자 수익 (ROI)의 위치를 결정하기 위해 통계적 다양한 접근 방법을 사용하여 구현되었지만, 일반적으로 라인 스캔 또는 의사 선 시간이 ^17에서 하나의 공간 차원으로 분석을 제한 스캔 이미지의 분석에 국한되어 ^19-22. 또한, 기존의 많은 알고리즘 캘리포니아주기, 지역화 과도에서 전파 파도 ^{(23, 24)에} 이르기까지 다양 ^{2 +} 릴리스 이벤트의 다양성을 포괄하기에 충분하지 않습니다. 생리 칼슘 ^{2 +} 신호의 종합 평가는 종종 더 큰 이미지의 인형도 만들고의 존재에 의해 복잡그 많은 실험 시스템의 잡음 차별 신호를 혼동 역할을합니다.

이전에, 캘리포니아에 자동 ROI 검출 알고리즘 솔루션 ^{2 +는} (건강, 베데스다, MD의 국립 연구소)가 개발하고 ^{(25), (26)을} 검증 된 NIH ImageJ에 소프트웨어를위한 플러그인으로 구현, 과도 감지 신호. LC_Pro 불리는이 알고리즘은 두 가지 차원의 시간 경과 이미지 시퀀스에서 칼슘 ^{2 +} 과도 신호를 포괄의 ROI를 확인하고 분석 할 수 있도록 설계되었습니다. 여기서 실제 실험 프로토콜 및 돼지 관상 동맥 내피의 알고리즘의 적용이 가능한 대표적인 데모 그래픽 출력을 생성하기 위해 오픈 소스 통계 처리 소프트웨어 R을 후 처리하여 추가로 제공된다.

Protocol

1. 선박의 해부 및 이미징 마틴 등 27에 설명 된대로 국내 청소년 돼지에서 수확 조직. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) HEPES는 생리 식염수 (PSS)를 버퍼 포함 아래 해부 접시에 수확 돼지 우심실을 놓습니다. 실체 현미경의 도움으로, 해부 주위 심장 조직의 층에서 혈관 세그먼트를 제거하여 집게와 봄 가위를 사용하여 주변 조직에서 관상 동맥 (~ 8mm 길이 0.5 mm 직경) 좌전 하행…

Representative Results

A custom algorithm, LC_Pro, was developed and implemented in order to perform automated analysis of Ca2+ dynamics on confocal image sequences. As depicted in Figure 1, the algorithm utilizes sequential processing modules that A) detect and track sites of dynamic Ca2+ change above statistical (p < 0.01) noise, B) define regions of interest (ROI) automatically at active site centers, and C) calculate average fluorescence intensities at ROIs to determine specific event parameters. …

Discussion

Decoding complex Ca²⁺ signals at the cellular and multicellular level will require rigorous experimental and analytical approaches. Here, an approach is described in which time resolved confocal image sequences of Ca²⁺ dependent fluorescence are subjected to an automated analysis that identifies and quantifies statistically relevant Ca²⁺ signals within intact cellular fields In the specific case presented, an artery segment was isolated from pig heart, pinned opened to expose the endothel…

Materials

dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
forceps	Fine Science Tools	#11223-20
spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
cover-glass bottom chamber			Custom designed
spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
imageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing