A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome
Summary
Mikrodissektion wurde ausgiebig für die Untersuchung von DNA, RNA und Protein in Gewebe eingesetzt. Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) ist die am häufigsten verwendete Methode, aber eine neue Frästechnik mesodissection ist kürzlich verfügbar. Wir zeigen, RNA-Extraktion aus Formalin fixiert mesodissected Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von Mycobacterium tuberculosis Granulome.
Abstract
Mikrodissektion wurde zur Untersuchung von Gewebe an DNA-, RNA-und Protein-Ebene für über ein Jahrzehnt verwendet. Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) ist die häufigste Mikrodissektion Technik heute verwendet. Bei dieser Technik wird ein Laser verwendet, um fokal Schmelze eines thermoplastischen Membran, die einen dehydrierten Gewebeschnitt 1 überlagert. Der Gewebeschnitt Verbund wird dann angehoben und von der Membran getrennt. Obwohl diese Technik erfolgreich zur Gewebeuntersuchung verwendet werden, ist es zeitaufwendig und teuer. Weiterhin ist die erfolgreiche Abwicklung der Verfahren unter Verwendung dieser Technik erfordert die Verwendung eines Lasers, wodurch ihre Verwendung eingeschränkt wird. Eine neue erschwingliche und praktische Mikrodissektion Ansatz namens mesodissection ist eine mögliche Lösung, um die Fallstricke der LCM. Diese Technik nutzt die MESO-1/MeSectr System zu fräsen das gewünschte Gewebe von einem Schlitten montiert Gewebeprobe während gleichzeitig Aufnahme und Abgabe Flüssigkeit, um die gewünschte Gewebeprobe in erholenein Verbrauchs Mühle wenig. Bevor die Dissektion Prozess beginnt, richtet der Anwender die Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) gleitet mit einer Hämatoxylin und Eosin (H & E)-Referenzrutsche. Danach annotiert der Bediener die gewünschte Dissektion Bereich und weiter zu den entsprechenden Segments zu sezieren. Das Programm erzeugt eine archivierte Bild der Dissektion. Der Hauptvorteil der mesodissection ist die kurze Dauer benötigt wird, um eine Folie zu zerlegen, wobei ein Durchschnitt von zehn Minuten von eingerichtet zu Generation in diesem Versuch probieren. Zusätzlich ist das System deutlich kostengünstiger und bedienerfreundlich. Ein kleiner Nachteil ist, dass es nicht so präzise wie Laser-Capture-Mikroskopie. In diesem Artikel zeigen wir, wie mesodissection kann verwendet werden, um RNA aus Folien aus FFPE Granulome durch Mycobacterium tuberculosis (Mtb) verursacht zu extrahieren.
Introduction
Die Proben wurden traditionell von Hand aus entweder ganze Gewebe oder Folien mit einer Nadel und Skalpell mikrodissektiert. Dies erfordert eine klare Trennung zwischen dem Gewebeschnitt des Interesses und der umgebenden Gewebe Abschnitten 2. Mit den Fortschritten in der aktuellen Molekularprofilierungstechnologie hat es einen zunehmenden Bedarf an Gewebe auf zellulärer Ebene zu bewerten. Aufgrund der Einschränkungen der manuellen Mikrodissektion wurden Techniken wie LCM gegründet, um größere Isolation Präzision ermöglichen. Diese Technik ermöglicht es dem Forscher, bestimmte Zellpopulationen aus verschiedenen Zelltypen und Objektträger, die dann für nachfolgende Assays wie Genexpressionsprofile verwendet werden können, zu isolieren. Obwohl sehr effektiv für die nachgeschalteten Tests ist LCM nicht ohne Einschränkungen. Erstens ist LCM ein teurer und zeitaufwendiger Prozess. Darüber hinaus aufgrund der instabilen Natur der RNA, ist es oft eine Herausforderung, qualitativ hochwertige RNA aus Proben LCM 2 zu erhalten. Aufgrund der disadvantages von LCM, werden neue Fortschritte in der Technologie-Mikrodissektion noch benötigt es leichter zugänglich für eine größere Anzahl von Forschern in einem erschwinglichen und zeitkritische Art und Weise zu machen.
Ein solcher Fortschritt in der Technologie-Mikrodissektion jetzt ist eine Technik, die als mesodissection bekannt. Bei dieser Technik wird eine Maschine zum Fräsen die kommentierte Gewebeschnitt von Interesse verwendet und saugt sie in eine Mühle Verbrauchs Bit 3. Weiter kann diese Probe in einem Sammelrohr angesaugt und für Downstream-Anwendungen verwendet werden. Die Vorteile dieses Systems sind, dass es wesentlich kostengünstiger und zeitempfindlich. Nach unseren Erfahrungen kann das System die Präparation eines Lungen Granulomgewebe Abschnitt in zehn Minuten. Auf der anderen Seite würde wahrscheinlich erfordern traditionelle LCM Stunden, um den Vorgang abzuschließen. Das System erlaubt es dem Bediener, eine Referenz Schlitten zu laden, um als Vergleichs sowie Werkzeug für Anmerkungen verwendet. Zusätzlich wird ein Bericht generiert umreißt the-Bereich der Folie, die seziert wurde. Es gibt zwei Hauptnachteile auf mesodissection. Obwohl wirksame Extraktion bei mehreren Zellen, ist es schwierig, eine einzelne Zelle zu isolieren. Darüber hinaus ist die Genauigkeit des erzeugten Bildes nicht so klar wie bei Verwendung anderer Abbildungs Mikroskopen.
Tuberkulose (TB) ist eine Infektionskrankheit, die großen Killer der Menschheit weltweit und Ergebnisse aus einer Infektion mit Mtb. In einer Mehrzahl von Individuen, Aerosole Mtb ausgesetzt wird, wird die Infektion latent beschränkt. In mindestens 10 Millionen Menschen jährlich, kommt es zu aktiven TB-Erkrankung 4. Während der latenten Infektion wird Mtb innerhalb pathologische Lungenläsionen als Granulome bekannte enthalten. So wurde argumentiert, dass das Ergebnis der Mtb-Infektion ist auf der Ebene des Granuloms 5 entschieden.
Hier zeigen wir, wie mesodissection kann verwendet werden, um Granulome von Mtb microdissect verursacht werden. Die verwendeten Foliensind von FFPE Lungengewebe von infizierten Rhesusaffen. Für den Zweck dieser Demonstration werden wir Granulomen in ihrer Gesamtheit zu sezieren. Wir zeigen auch, dass RNA aus dem wiederhergestellten Gewebe extrahiert werden. Diese Technik kann auf Gewebeproben von verschiedenen anderen Proben aufgetragen und dann für eine Vielzahl von Downstream-Assays verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection ist eine Technik, die RNA-Extraktion aus pathologischen Läsion gleitet durch eine Vielzahl von Krankheitserregern verursacht angewendet werden können. Es ist eine Notwendigkeit, dass der Benutzer verfolgt das Bild und das Bild richtig ausgerichtet ist. Um dies zu erreichen, muss das Gerät nach den Anweisungen auf dem Imaging-Software kalibriert werden. Bei der Analyse, wenn die Dia-und Interessengebiet seziert nicht passen, muss der Benutzer das Gerät neu kalibriert werden. Ein weiterer wichtiger Schr…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die folgenden Auszeichnungen NIH / subawards für die Unterstützung dieser Forschung zu bestätigen: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08 und P51OD011104.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
Referenzen
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