回復への新規マイクロダイセクションアプローチ<em>結核菌</em肺肉芽腫、ホルマリン固定パラフィン包埋から>特異的転写
Summary
顕微解剖は、広範囲の組織内のDNA、RNA、およびタンパク質の試験のために使用されている。レーザーキャプチャー顕微鏡（LCM）は、最も一般的に使用される方法ですが、新しい製粉技術、mesodissectionは、最近になって提供されています。私たちは、 結核菌肉芽腫の組織スライドを組み込みmesodissectedホルマリン固定パラフィンからのRNA抽出を示しています。
Abstract
顕微解剖は、10年以上にわたってDNA、RNA、およびタンパク質レベルでの組織の検査のために使用されている。レーザーキャプチャー顕微鏡（LCM）は本日、使用される最も一般的なマイクロダイセクション法である。この技術では、レーザーは、局所的に脱水された組織部1の上に重なる熱可塑性膜を溶融するために使用される。組織切片複合体は、その後持ち上げられ、膜から分離される。この技術は、組織検査のために首尾よく使用することができるが、それは時間がかかり、高価である。さらに、この技術を用いる手順が正常に完了し、したがって、その使用を制限する、レーザの使用を必要とする。 mesodissectionと呼ばれる新しい、より手頃な価格で実用的な顕微解剖法は、LCMの落とし穴に可能な解決策である。この技術は、ミルに取り付けられたスライド組織試料から所望の組織をMESO-1/MeSectr方式を採用し、同時に中に所望の組織試料を回収するための流体を分配し、吸引しながら消耗旋削ビット。解剖プロセスが始まる前に、ユーザは（FFPE）ホルマリン固定パラフィン包埋染色、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）参照スライド摺動整列する。その後、オペレータは、所望の解剖領域に注釈し、適切なセグメントを解剖に進む。プログラムは、解剖のアーカイブされた画像を生成する。 mesodissectionの主な利点は、この実験で世代をサンプリングするように設定から10分の平均を取って、スライドを分析するのに必要な短い期間です。さらに、システムを大幅に、より効果的なコストで使いやすいです。わずかな欠点は、レーザーキャプチャー顕微鏡法ほど正確ではないことである。この記事では、mesodissectionは、FFPEからのスライドからRNAを抽出するために使用する方法を示し結核菌（MTB）に起因する肉芽腫。
Introduction
サンプルは、伝統的に手動で針とメスを用いて、全組織またはスライドのいずれかから顕微解剖されています。これは、対象の組織切片と周囲の組織切片2との間に明確な分離を必要とする。分子プロファイリング技術の現在の進歩により、細胞レベルで組織を評価する必要性が高まってきた。により手動マイクロダイセクションの制限のため、LCMを含む技術が高いアイソレーションの精度を可能にするために設立された。この技術は、研究者は、そのような遺伝子発現プロファイリングのような下流アッセイのために使用することができる様々な細胞及びスライド型から特定の細胞集団を単離することができる。ダウンストリームアッセイのために非常に効果的ではあるが、LCMには限界がないわけではない。まず、LCMは、高価で時間のかかるプロセスである。さらに、RNA起因の不安定な性質のために、それは多くの場合、LCM試料2から高品質のRNAを得るために挑戦している。ディによるLCMのsadvantagesは、マイクロダイセクション技術の新たな進歩はまだ手頃な価格と時間に敏感な方法で、研究者がより多くのことをよりアクセシブルにするために必要です。
利用できるようになりまし顕微解剖技術の一つは、このような進歩は、mesodissectionとして知られている技術である。この技術では、機械は工場に関心のある注釈付き組織切片を使用し、消耗品の旋削ビット3にそれを吸引する。次に、このサンプルは、収集チューブ内に吸引し、下流の用途に使用することができる。このシステムの利点は、それが大幅に少ない費用と時間が敏感であることである。我々の経験では、システムは10分で肺肉芽腫組織切片の解剖を可能にします。一方、伝統的なLCM可能性が高いプロセスを完了するために時間が必要となる。このシステムは、オペレータが比較だけでなく、注釈のためのツールとして使用するために、参照スライドをロードすることができます。さらに報告書はアウトライン番目に生成されます解剖したスライドのEエリア。 mesodissectionするには2つの主な欠点があります。複数のセルを抽出するのに有効であるが、単一細胞を単離するために挑戦している。また、生成された画像の精度は他のイメージング顕微鏡を使用している場合ほど明確ではありません。
結核（TB）は、世界中の人間性とマウンテンバイクでの感染からの結果の主要な感染症キラーです。 マウンテンバイクのエーロゾルに暴露された個人の大半では、感染は潜伏限られている。毎年少なくとも10万人では、活動性結核4になる。潜伏感染時に、 マウンテンバイクは、肉芽腫として知られている病的な肺病変の中に含まれている。そのためには、 マウンテンバイクの感染の結果は肉芽腫5のレベルで決定されていると主張してきた。
ここでは、mesodissectionはマウンテンバイクに起因する肉芽腫を顕微解剖するために使用することができる方法を示します。スライドを使用感染したアカゲザルからのFFPE肺組織からのものである。このデモの目的のために、我々は、その全体が肉芽腫を分析します。我々はまた、RNAを回収した組織から抽出することができることを実証している。この技術は、様々な他の標本から組織サンプルに適用し、次いで、下流の種々のアッセイのために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissectionは、病原体の広大な配列に起因する病理学的病変スライドからRNA抽出にも適用することができる技術である。これは、ユーザが画像を追跡し、画像を正しく整列させる必要があることである。これを達成するために、測定器はイメージングソフトウェアの指示に従って校正する必要があります。解剖すると解剖されている関心のスライドと面積が整列していない場合、ユーザは、?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01HL106790、R01HL106790-S1、R01HL106786、R01AI089323、R21AI091457、R21RR026006、P20RR020159、C06RR017563、8T32OD011124-08、およびP51OD011104：著者らは、この研究のサポートについては、次のNIH賞/ subawardsを承認したいと思います。
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
Referenzen
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