Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando<em> Mycobacterium tuberculosis</em> transcritos específicos de formalina fixo Parafina incorporado Lung granulomas
Summary
Microdissecção tem sido extensivamente utilizada para a análise de DNA, RNA e proteínas dentro do tecido. Microscopia captura a laser (LCM) é o método mais comumente utilizado, mas uma nova técnica de fresagem, mesodissection, é recentemente disponível. Demonstramos extração de RNA a partir de mesodissected formalina parafina fixo lâminas de tecido embebidos de Mycobacterium tuberculosis granulomas.
Abstract
Microdissecção foi usado para o exame de tecidos em ADN, ARN, e os níveis de proteína de mais de uma década. Microscopia captura a laser (LCM) é a técnica de microdissecção mais comum usado hoje. Nesta técnica, um laser é usado para fundir focalmente uma membrana termoplástica que se sobrepõe uma secção de tecido 1 desidratado. O compósito secção de tecido é então levantada e separada da membrana. Embora esta técnica pode ser utilizada com sucesso para a análise de tecido, que é demorado e caro. Além disso, a conclusão bem sucedida de procedimentos que utilizam esta técnica requer a utilização de um laser, limitando assim o seu uso. Uma nova abordagem microdissection mais acessível e prático chamado mesodissection é uma possível solução para as armadilhas da LCM. Esta técnica utiliza o sistema de MESO-1/MeSectr moer o tecido desejado a partir de uma amostra de tecido montada deslizante, enquanto simultaneamente a distribuição e aspiração de fluido para recuperar a amostra de tecido desejado emum pouco moinho consumível. Antes do processo de dissecação começa, o usuário alinha a parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) deslizar com hematoxilina e eosina (H & E) referência slide. Depois disso, o operador anota a área de dissecção desejada e prossegue para dissecar o segmento apropriado. O programa gera uma imagem arquivada da dissecção. A principal vantagem do mesodissection é a curta duração necessária para dissecar um slide, tendo uma média de 10 minutos de set up para provar geração neste experimento. Além disso, o sistema é muito mais rentável e fácil de usar. Um pequena desvantagem é que não é tão precisa como a microscopia de captura laser. Neste artigo, vamos demonstrar como mesodissection pode ser usado para extrair RNA de slides de granulomas FFPE causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduction
As amostras foram tradicionalmente microdissecado manualmente a partir de qualquer tecido ou conjunto lâminas usando uma agulha e bisturi. Isto exige uma separação clara entre a secção de tecido de interesse e tecidos circundantes pontos 2. Com os avanços na tecnologia actual perfil molecular, tem havido uma necessidade cada vez maior para avaliar tecidos ao nível celular. Devido às limitações de microdissecção manual, foram estabelecidas técnicas, incluindo LCM para permitir uma maior precisão isolamento. Esta técnica permite ao investigador para isolar populações de células específicas a partir de vários tipos de células e de deslizamento, que podem então ser utilizadas para ensaios a jusante, tais como a expressão do gene de perfil. Embora muito eficaz para ensaios a jusante, GCV não é sem limitações. Primeiro, LCM é um processo caro e demorado. Além disso, devido à natureza instável do ARN, que é muitas vezes difícil obter o RNA de alta qualidade a partir de amostras de LCM 2. Devido ao disadvantages de LCM, novos avanços na tecnologia microdissection ainda são necessários para torná-lo mais acessível a um maior número de pesquisadores, de forma sensível a preços acessíveis e de tempo.
Um tal avanço da tecnologia microdissection agora está disponível uma técnica conhecida como mesodissection. Nesta técnica uma máquina é usada para moer a secção de tecido anotada de juros e aspira-lo em um consumível pouco moinho 3. Em seguida, essa amostra pode ser aspirado para dentro de um tubo de coleta e usado para aplicações a jusante. As vantagens deste sistema são que é significativamente menos dispendioso e sensíveis ao tempo. Em nossa experiência, o sistema permite a dissecação de uma secção de tecido granuloma pulmonar em dez minutos. Por outro lado, o LCM tradicional seria provável exigir horas para completar o processo. O sistema permite que o operador carregar uma lâmina de referência a ser usado como uma comparação, bem como ferramenta para anotação. Além disso, um relatório é gerado descrevendo ªárea e do slide que foi dissecado. Há duas principais desvantagens para mesodissection. Embora eficaz na extração de várias células, é um desafio para isolar uma única célula. Além disso, a precisão da imagem gerada não é tão clara como se estivesse usando outros microscópios de imagem.
A tuberculose (TB) é um grande assassino de doenças infecciosas da humanidade em todo o mundo e resulta de infecção por M. tuberculosis. Na maioria dos indivíduos expostos a aerossóis de Mtb, a infecção é latente limitado. Em pelo menos 10 milhões de pessoas por ano, que resulta em doença tuberculose ativa 4. Durante a infecção latente, Mtb está contido dentro de lesões pulmonares patológicos conhecidos como granulomas. Por isso, tem-se argumentado que o resultado de infecção por M. tuberculosis é decidido ao nível do granuloma 5.
Aqui demonstramos como mesodissection pode ser usado para microdissect granulomas provocadas por M. tuberculosis. Os slides utilizadossão de FFPE tecido pulmonar de macacos rhesus infectados. Para o propósito desta demonstração, vamos dissecar granulomas na sua totalidade. Também demonstramos que o RNA pode ser extraído a partir do tecido recuperado. Esta técnica pode ser aplicada a amostras de tecidos de várias outras amostras e, em seguida, utilizados para uma variedade de ensaios a jusante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection é uma técnica que pode ser aplicada para a extracção de ARN a partir de lâminas de lesões patológicas causadas por uma vasta gama de agentes patogénicos. É uma necessidade que o usuário acompanha a imagem e se alinha a imagem corretamente. Para conseguir isso, o instrumento deve ser calibrado de acordo com as instruções sobre o software de imagem. Ao dissecar, se o slide e área de interesse a ser dissecado não se alinham, o usuário deve recalibrar o instrumento. Outro passo importante no pr…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer aos seguintes prêmios NIH / subawards para o apoio a esta pesquisa: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, e P51OD011104.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
Referenzen
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection–increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
- Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
- . Mesodissection of fibrous tissue. AvanSciBio. , (2013).
- Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe’s point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
- Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
- Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
- Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).
