In Vitro Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori

Summary

Il metodo di coltura tridimensionale descritto in questo protocollo ricapitola sviluppo pancreas dispersi da progenitori topo pancreas embrionali, compresa la loro notevole espansione, differenziazione e morfogenesi in un organo ramificato. Questo metodo è suscettibile di immagini, interferenze funzionali e manipolazione della nicchia.

Abstract

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells ¹. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development ^2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.

We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.

We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.

Introduction

Cultura Organ fornisce un modello utile che colma il divario tra il complesso, ma di grande rilevanza nelle indagini vivo e conveniente, ma approssimativa simulazione di modelli di linee cellulari. Nel caso del pancreas, non vi è alcuna linea cellulare perfettamente equivalente a progenitori pancreas anche se ci si trasformano linee cellulari che simulano cellule endocrine ed esocrine. L'intero pancreas adulto non può essere coltivato; isolato isolotti endocrini possono essere mantenuti per poche settimane senza proliferazione cellulare e fette di tessuto possono essere tenuti in vitro per alcune ore ^5. Cultura pancreas embrionale è stato ampiamente utilizzato non solo per studiare il suo sviluppo, ma anche per indagare interazioni epitelio-mesenchimale ^4,6,7, all'immagine processi ⁸ o interferire chimicamente con essi ^9. Due organi metodi di coltura sono utilizzati principalmente: la prima consiste nella coltura gemme pancreatiche su piastre rivestite di fibronectina ^2, che è conveutile per gli scopi di imaging; la seconda opzione è quella di cultura organi sui filtri all'interfaccia aria-liquido ^3,4 che meglio conserva morfogenesi. Sebbene molto utile, questi metodi portano ad un certo grado di appiattimento; l'espansione di progenitori è molto limitato rispetto al normale sviluppo e la popolazione di partenza è complesso comprendente tutti i tipi di cellule pancreatiche e cellule mesenchimali.

La capacità di cultura ed espandere cellule primarie disperse è prezioso per studiare le relazioni lignaggio e scoprire le proprietà intrinseche dei tipi di cellule isolate ^10. Sugiyama et al ^11. Potrebbe mantenere progenitori pancreas e progenitori endocrini che hanno conservato alcuni caratteri funzionali per 3-5 giorni di coltura su livelli di alimentazione. Pancreatospheres, simile a neurospheres ¹² e mammospheres ^13, sono stati espansi da isolotti adulte e cellule duttali sebbene la natura dei progenitori / cellule staminaliche generano queste sfere non è chiaro. Inoltre, in contrasto con sviluppo fisiologico, i pancreatospheres contenevano alcuni neuroni ^14,15. Spheres sono stati recentemente realizzati da progenitori pancreas embrionale ^16,17 e rigenerante pancreas ¹⁸ con buona espansione progenitrici e la successiva differenziazione, ma non è riuscito a riepilogare morfogenesi.

Modelli 3D da cellule disperse e spesso definiti che l'auto-organizzano in organi miniaturizzati hanno recentemente fiorito e simulare lo sviluppo o adulto fatturato di più organi quali l'intestino ^{19,20, 21} stomaco, il fegato ^22, la prostata ²³ e la trachea ^24. In alcuni casi, la morfogenesi di sviluppo e differenziazione sono stati riassunti in 3D da cellule ES, come è il caso di tazze ottiche ^{25, 26} o intestino cerebrali ^27.

Qui, desCRIBE un metodo per espandere dissociate progenitori pancreatici multipotenti in un ponteggio 3D Matrigel dove possono differenziarsi e di auto-organizzarsi.

Protocol

Questo protocollo mira a far crescere organoidi pancreatiche derivate da E10.5 murino dissociate cellule pancreatiche epiteliali. Il protocollo richiede l'approvazione etica per la sperimentazione animale. 1. Dissezione della gemma dorsale del pancreas da E10.5 embrioni di topo Sacrifica il topo gravide temporizzata a giorno embrionale (E) 10.5, aprire l'addome con un paio di forbici, rimuovere le due corna uterine e metterli in un piatto di 10…

Representative Results

E10.5 dorsali progenitori pancreatici dissociate e seminate in 3D Matrigel ricapitolano sviluppo del pancreas. Progenitori possono essere più facilmente seguiti con i giornalisti fluorescenti. Nel nostro caso abbiamo utilizzato un topo transgenico che esprime una proteina GFP nucleare controllata dal promotore Pdx1 (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (film 1) in assenza di tamoxifene e quindi senza attivare NEUROG3 4 (Figura 2). Con il mezzo organoide, una…

Discussion

La produzione su larga scala delle cellule beta funzionali in vitro è ancora inefficace ^1. In questo contesto impegnativo, studi di biologia dello sviluppo possono aiutare decifrare i segnali esatti che sono necessari per la differenziazione delle cellule beta funzionali. Questo protocollo consente per la manutenzione, l'espansione e la differenziazione di progenitori pancreatici embrionali in vitro. Ciò include la formazione di cellule beta produttrici di insulina che non co-express a…

Materials

Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
KnockOut Serum replacement (supplement)	Gibco	10828-028	Stock keept at -20°C
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	3148-25ML	Stock keept at 4°C
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Calbiotech	524400-1MG	Stock keept at -20°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	Stock keept at -80°C
Recombinant Human R-spondin 1	R&D	4645-RS-025/CF	Stock keept at -80°C
- or -
Recombinant Mouse R-spondin 1	R&D	3474-RS-050	Stock keept at -80°C
Recombinant Human FGF1 (aFGF)	R&D	232-FA-025	Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin)	Drossapharm		Stock keept at 4°C
Recombinant Human FGF10	R&D	345-FG-025	Stock keept at -80°C
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
B27 x50 (supplement)	Gibco	17504-044	Stock keept at -20°C
Recombinant Human FGF2 (bFGF)	R&D	233-FB-025	Stock keept at -80°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Matrigel	Corning	356231	Stock keept at -20°C
Trypsin 0.05%	Gibco	25300-054	Stock keept at 4°C
RNAlater – RNA stabilizing reagent	Qiagen	76104	Store at room temperature
Dispase	Sigma Aldrich	D4818-2MG	Stock keept at -20°C
BSA for reconstitution	Milipore	81-068	For reconstituition of cytokines  – Stock keept at -20°C
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	16141079	Stock keept at -20°C
60 well MicroWell trays	Sigma Aldrich	M0815-100EA
4-well plates	Thermo Scientific	176740
95-well plates F bottom	Greiner Bio	6555180
Glas bottom plates	Ibidi	81158
Disposal micropittes	Blaubrand	708745