Экстракорпоральное поджелудочной железы Organogenesis от дисперсных мышиных эмбриональных прародителей

Summary

Трехмерная способ культивирования описано в данном протоколе повторяет развитие поджелудочной железы от дисперсных эмбриональных клеток-предшественников мышь поджелудочной железы, включая их существенного расширения, дифференцировки и морфогенеза в разветвленной органа. Этот метод поддается визуализации, функциональной вмешательства и манипуляции нише.

Abstract

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells ¹. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development ^2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.

We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.

We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.

Introduction

Органная культура предоставляет полезную модель, мосты разрыв между комплекса, но весьма актуальны в естественных условиях исследований и удобный, но приблизительное моделирование моделей клеточных линий. В случае поджелудочной железы, нет клеточной линии совершенно эквивалентна поджелудочной железы предшественников хотя преобразуются клеточных линий, имитирующих эндокринных и экзокринных клетках. Весь поджелудочной железы взрослых не могут культивироваться; изолированные эндокринные островки может поддерживаться в течение нескольких недель без клеточной пролиферации и Срезы ткани могут быть сохранены в пробирке в течение нескольких часов ^5. Эмбриональные поджелудочной железы культура была широко используется не только для изучения ее развитие, но и исследовать эпителиальные-мезенхимальных взаимодействия ^4,6,7, чтобы изображение обрабатывает ⁸ или химически мешать них ^9. Два органа способы культивирования в основном используются: первый заключается в культивировании поджелудочной рецепторы на фибронектина покрытием пластин ^2, что является удобnient для целей визуализации; Второй вариант заключается в культуре органы на фильтрах на воздух и жидкой фаз ^3,4, который наилучшим образом сохраняет морфогенез. Хотя очень полезно, эти методы приводят к определенной степенью выравнивания; расширение предшественников очень ограничено по сравнению с нормальным развитием и исходного население комплекс, включающий все типы клеток поджелудочной железы и клеток мезенхимы.

Возможность культуры и расширить распределенных первичных клеток является ценным для изучения клональные отношения и раскрыть внутренние свойства изолированных типов клеток ^10. Сугияма и др. ^11. Может поддерживать поджелудочной железы предшественников и эндокринные клетки-предшественники, которые сохранили некоторые функциональные символы в течение 3-5 дней в культуре на фидерных слоях. Pancreatospheres, сродни нейросферы ¹² и mammospheres ^13, были расширены от взрослых островков и протоков клеток хотя природа прародителей / стволовых клеток, которые генерируют эти сферы не ясно. Кроме того, в отличие от физиологического развития, pancreatospheres содержится некоторые нейроны ^14,15. Сферы были также недавно получены из эмбриональных поджелудочной железы предшественников ^16,17 и регенерации поджелудочных желез ¹⁸ с хорошим расширением предшественников и последующего дифференцирования, но не повторять морфогенез.

3D модели от дисперсных и часто определенных клеток, которые самоорганизуются в миниатюрных органов в последнее время процветала и имитации развития или взрослых оборот нескольких органов, таких как кишечник ^19,20, желудка ^21, печень ²² простаты ²³ и трахеи ^24. В некоторых случаях, морфогенез развития и дифференциации были обобщены в 3D от ЭС клеток, как это имеет место в оптических чашек ^{25, 26} кишечник или головного мозга ^27.

Здесь мы десывают способ расширить диссоциированные мультипотентные поджелудочной предшественники в эшафот 3D Matrigel, где они могут дифференцироваться и самоорганизовываться.

Protocol

Этот протокол направлен расти поджелудочной органоиды, полученные из мышиных E10.5 диссоциирован эпителиальные клетки поджелудочной железы. Протокол требует этического одобрения экспериментов на животных. 1. Препарирование спинной поджелудочной Bud от E10.5 …

Representative Results

E10.5 спинной поджелудочной предшественники диссоциированные и высевают в 3D Матригель резюмировать развитие поджелудочной железы. Предшественники легче всего следуют с люминесцентными журналистами. В нашем случае мы использовали трансгенных мышей, которая выражает ядерного GFP белка ?…

Discussion

Крупномасштабное производство функциональных бета-клеток в пробирке остается неэффективной ^1. В этом сложном контексте, развития биологические исследования могут помочь расшифровать точные сигналы, которые необходимы для дифференциации функциональных бета-клеток. Этот п…

Materials

Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
KnockOut Serum replacement (supplement)	Gibco	10828-028	Stock keept at -20°C
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	3148-25ML	Stock keept at 4°C
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Calbiotech	524400-1MG	Stock keept at -20°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	Stock keept at -80°C
Recombinant Human R-spondin 1	R&D	4645-RS-025/CF	Stock keept at -80°C
- or -
Recombinant Mouse R-spondin 1	R&D	3474-RS-050	Stock keept at -80°C
Recombinant Human FGF1 (aFGF)	R&D	232-FA-025	Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin)	Drossapharm		Stock keept at 4°C
Recombinant Human FGF10	R&D	345-FG-025	Stock keept at -80°C
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
B27 x50 (supplement)	Gibco	17504-044	Stock keept at -20°C
Recombinant Human FGF2 (bFGF)	R&D	233-FB-025	Stock keept at -80°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Matrigel	Corning	356231	Stock keept at -20°C
Trypsin 0.05%	Gibco	25300-054	Stock keept at 4°C
RNAlater – RNA stabilizing reagent	Qiagen	76104	Store at room temperature
Dispase	Sigma Aldrich	D4818-2MG	Stock keept at -20°C
BSA for reconstitution	Milipore	81-068	For reconstituition of cytokines  – Stock keept at -20°C
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	16141079	Stock keept at -20°C
60 well MicroWell trays	Sigma Aldrich	M0815-100EA
4-well plates	Thermo Scientific	176740
95-well plates F bottom	Greiner Bio	6555180
Glas bottom plates	Ibidi	81158
Disposal micropittes	Blaubrand	708745