분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

Summary

이 프로토콜에 기재된 삼차원 배양법 분지 기관에 자신의 상당한 팽창, 분화 및 형태 발생을 포함한 분산 배아 마우스 췌장 전구 세포로부터 췌장 개발 되풀이되었습니다. 이 방법은 영상, 틈새 시장의 기능 장애 및 조작에 대한 의무입니다.

Abstract

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells ¹. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development ^2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.

We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.

We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.

Introduction

장기 문화는 생체 내 연구에서 복잡하지만 관련성이 높은 사이의 간격 및 세포 라인 모델의 편리하지만 대략적인 시뮬레이션을 다리에 유용한 모델을 제공합니다. 췌장의 경우, 내분비와 외분비 세포 시뮬레이션 세포주가 변형 되더라도 췌장 전구 세포로 완전히 동등한 어떠한 세포주도 없다. 성인 전체 췌장을 배양 할 수 없습니다; 절연 내분비 아일렛 세포 증식없이 몇 주 동안 유지 될 수 있으며, 조직 조각은 몇 ^{시간에서 5} 시험 관내에서 유지 될 수있다. 배아의 췌장 문화가 널리 개발을 연구뿐만 아니라 사용되었습니다뿐만 아니라 ^8을 처리하는 이미지로, 상피 – 간엽 상호 작용 ^4,6,7을 조사하기 위해 화학적으로 그 ⁹ 방해 할 수 있습니다. 두 기관 배양 방법이 주로 사용된다 : 첫 번째는 conve입니다 피브로넥틴 코팅 플레이트 ^2에 췌장 꽃 봉오리를 배양에 구성촬상 목적 더욱 편리 할; 두 번째 옵션은 문화에 가장 형태 형성을 유지 공기 – 액체 인터페이스 ^3,4에서 필터에 대한 기관입니다. 매우 유용하지만, 이러한 방법은 평탄화의 어느 정도 이어질; 정상적인 발달에 비해 시작 인구가 췌장 세포 및 중간 엽 세포의 모든 유형을 포함하는 복잡한 같이 선조의 팽창은 매우 제한된다.

문화 능력과 분산 일차 전지를 확장 계보 관계를 연구하고 고립 된 세포 유형 ^(10)의 고유 특성을 발견 할 가치가있다. 스기야마 등. ¹¹ 췌장 전구 세포 및 피더 레이어에 문화에 3 ~ 5 일 일부 기능 문자를 유지 내분비 전구 세포를 유지할 수 있습니다. 조상의 자연 / 줄기 세포하지만 neurosphere를 ^{12, 13} mammospheres에 가깝다 Pancreatospheres는 성인 독도 및 유관 세포에서 확장되었습니다이러한 분야를 생성하는 것은 명확하지 않다. 또, 생리 현상과는 대조적으로, pancreatospheres 일부 뉴런에게 ^14,15을 함유 하였다. 분야는 최근 배아 췌장 전구 세포 ^{(16, 17)과} 좋은 시조 확장 이후의 분화와 pancreata ¹⁸ 재생에서 생산하지만, 형태 형성을 요점을 되풀이하는 데 실패했다.

소형 기관에 자체 조직으로 분산 종종 정의 세포에서 3D 모델은 최근 번성하고 소장 ^{(19, 20),} 배 ^(21), 간 ^(22), 전립선 ^(23)과 기관 등의 여러 장기의 개발 또는 성인 매출을 시뮬레이션 한 ^24. 광섬유 컵 ^{25, 26} 또는 뇌 부위 ^(27)의 경우와 같이 몇몇 경우에, 형태 형성 발달과 분화는, ES 세포로부터 3D로 효과적으로 요약되었다.

여기, 우리 DES그들은 차별화 자체 구성 할 수 있습니다 3D 리겔 비계에서 해리 다 능성 췌장 전구 세포를 확장하는 방법을 cribe.

Protocol

이 프로토콜은 쥐 E10.5에서 파생 된 췌장 organoids 상피 췌장 세포를 해리 성장하는 것을 목표로하고있다. 이 프로토콜은 동물 실험에 대한 윤리적 승인을 필요로합니다. E10.5 마우스 배아에서 지느러미 췌장 버드 1. 해부 가위로 복부를 열고 배아 일 (E) 10.5 초과 임신 쥐를 희생, 두 자궁 뿔을 제거하고 차가운 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 또는 둘 베…

Representative Results

3D 리겔에서 해리와 시드 E10.5 지느러미 췌장 전구 세포는 췌장 개발을 요점을 되풀이하다. 조상은 쉽게 형광 기자와 올 수 있습니다. 우리의 경우 우리는 (그림 2) Neurog3 4 활성화하지 않고 타목시펜의 부재에 따라서 Pdx1 프로모터 (Pdx1 – Ngn3-ER TM-nGFP) (동영상 1)에 의해 제어되는 핵 GFP 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스를 사용. organoid 매체?…

Discussion

시험 관내에서 기능적인 베타 세포의 대규모 생산은 여전히 ^하나 비효율적이다. 이 도전적인 상황에서, 발달 생물학 연구 기능의 베타 세포의 분화에 필요한 정확한 신호를 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 체외에서 배아의 췌장 전구 세포의 유지 보수, 확장과 차별화 할 수 있습니다. 이것은 다른 내분비 호르몬을 공동으로 표현하지 않는 인슐린을 생산?…

Materials

Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
KnockOut Serum replacement (supplement)	Gibco	10828-028	Stock keept at -20°C
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	3148-25ML	Stock keept at 4°C
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Calbiotech	524400-1MG	Stock keept at -20°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	Stock keept at -80°C
Recombinant Human R-spondin 1	R&D	4645-RS-025/CF	Stock keept at -80°C
- or -
Recombinant Mouse R-spondin 1	R&D	3474-RS-050	Stock keept at -80°C
Recombinant Human FGF1 (aFGF)	R&D	232-FA-025	Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin)	Drossapharm		Stock keept at 4°C
Recombinant Human FGF10	R&D	345-FG-025	Stock keept at -80°C
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
B27 x50 (supplement)	Gibco	17504-044	Stock keept at -20°C
Recombinant Human FGF2 (bFGF)	R&D	233-FB-025	Stock keept at -80°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Matrigel	Corning	356231	Stock keept at -20°C
Trypsin 0.05%	Gibco	25300-054	Stock keept at 4°C
RNAlater – RNA stabilizing reagent	Qiagen	76104	Store at room temperature
Dispase	Sigma Aldrich	D4818-2MG	Stock keept at -20°C
BSA for reconstitution	Milipore	81-068	For reconstituition of cytokines  – Stock keept at -20°C
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	16141079	Stock keept at -20°C
60 well MicroWell trays	Sigma Aldrich	M0815-100EA
4-well plates	Thermo Scientific	176740
95-well plates F bottom	Greiner Bio	6555180
Glas bottom plates	Ibidi	81158
Disposal micropittes	Blaubrand	708745