Electroporation للمن المستجيبات البكتيرية وظيفية في خلايا الثدييات

Summary

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Abstract

دراسة التفاعلات البروتين في سياق الخلايا الحية يمكن أن تولد المعلومات الهامة حول توطين والديناميكية وشركاء التفاعل. هذه المعلومات هي قيمة خاصة في سياق التفاعلات المضيف الممرض. العديد من البروتينات الممرض تعمل داخل الخلايا المضيفة في مجموعة متنوعة من طريقة مثل، مما يتيح التهرب من الجهاز المناعي المضيفة والبقاء على قيد الحياة في البيئة داخل الخلايا. لدراسة هذه الممرض البروتين التفاعلات الخلية المضيفة، وتستخدم عدة نهج شيوعا، بما في ذلك: في إصابة الجسم الحي مع سلالة التعبير عن بروتين الموسومة أو متحولة، أو إدخال جينات الممرض عبر ترنسفكأيشن أو تنبيغ. كل من هذه الطرق لها مزايا وعيوب. سعينا وسيلة لإدخال مباشرة البروتينات الخارجية إلى داخل الخلايا. يستخدم Electroporation للعادة لتقديم الأحماض النووية في خلايا، ولكن تم أكثر نادرا ما تطبق على البروتينات على الرغم من أن أساس فيزيائي حيوي هو نفسه تماما.تم استخدام electroporator القياسية لإدخال مؤثرات تقارب الموسومة البكتيرية إلى خلايا الثدييات. كان المثقف خلايا البلاعم الظهارية والفأر الإنسان من خلال الطرق التقليدية، فصل، ووضعها في 0.4 سم cuvettes الفجوة Electroporation للمع البروتين البكتيري الممرض خارجي من الفائدة (على سبيل المثال السالمونيلا التيفية الفأرية GtgE). بعد Electroporation لل(0.3 كيلو فولت) والقصيرة (4 ساعات) فترة نقاهة، تم التحقق من البروتين داخل الخلايا التي وصفها fluorescently البروتين عن طريق بطاقة تقارب ودراسة التوزيع المكاني والزماني بواسطة المجهر متحد البؤر. وقد تبين أن البروتين electroporated أيضا لتكون وظيفية داخل الخلية وقادرة على الاتجار التحت خلوية الصحيح والتفاعل البروتين البروتين. في حين تميل البروتينات الخارجية لتتراكم على سطح الخلايا، فان عينات electroporated زيادات كبيرة في داخل الخلايا تركيز المستجيب نسبة إلى الحضانة وحدها. بروتوكول بسيط وسريع بما فيه الكفاية مما يتعين القيام به في ا ف بالأزياء arallel، والسماح لتوصيف عالية الإنتاجية للبروتينات الممرض في الخلايا المضيفة بما في ذلك استهداف التحت خلوية وظيفة البروتينات الفوعة.

Introduction

العديد من الجراثيم سلبية الغرام تستخدم أنظمة إفراز المتخصصة لحقن البروتينات المرتبطة الفوعة (ويشار إلى المستجيبات) مباشرة في الخلايا المضيفة ^1-5. هذه المؤثرات لديها مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية بما في ذلك: قمع الحصانة المضيف، والتغيرات هيكل الخلية، وتعديل الاتجار داخل الخلايا والإشارات، والتغيرات النسخي، والتعديلات proteasome والمضيف ^6-9. ومن المعروف وظائف بعض المؤثرات، ولكن الأهداف المضيفة وعمل الكيمياء الحيوية (ق) من كثيرين آخرين لا تزال يحدد لاحقا. في حين المقارنة بين النوع البري والالتهابات البكتيرية المؤتلف هو نهج صحيح لدراسة آليات المستجيب الفوعة داخل الخلايا، غالبا ما يكون من المفيد أن استحداث المستجيب الفردي في الخلية المضيفة. وهكذا، طرق بسيطة لإدخال وتميز البروتينات المستجيب البكتيرية في سياق الخلايا المضيفة أمر مرغوب فيه للغاية.

تبسيط التحليل واي تجريبيعشر على المستجيب واحد أمر بالغ الأهمية كما المستجيبات أخرى قد يكون لها وظائف معارضة أو زائدة عن الحاجة. لإنجاز هذا التبسيط، وأدخلت الباحثين سابقا الجزيئات إلى الخلايا عن طريق العديد من الطرق المختلفة، بما في ذلك تنبيغ الفيروسية ^10، حقن مكروي ^11، كشط تحميل ^12،13، والانصهار مع خلية يسببها كيميائيا حقن مكروي ¹⁴ والبروتين الملكية "ترنسفكأيشن" الكواشف ^15، رواسب فوسفات الكالسيوم ^16، و electroporation ^17-20. وتتراوح جزيئات عرض من الأحماض النووية بما في ذلك الأنواع DNA، RNA، ورني للبروتينات، والأصباغ خلايا كتيمة، والأجسام المضادة لأهداف داخل الخلايا ^21،22. بعض الطرائق حدودها بما في ذلك نوع من جزيء التي يمكن إدخالها، ويمكن أن تكون خاصة التحليلات المصب محدودة نظرا لسمية عالية الخلوية، وآليات الضارة للعمل، فعالية منخفضة، أو الكفاءة المقدمة. ترنسفكأيشن، وهو ofteطريقة ن استخدامها للتعبير عن الجينات البكتيرية في خلايا الثدييات، كما يعاني القيد أن بعض أنواع الخلايا المضيفة ذات الصلة، مثل الضامة والخلايا الأولية، هي مقاومة وخاصة تجاه ترنسفكأيشن. أبعد من ذلك، فمن الصعب السيطرة على مستويات البروتين البكتيري تنتج على إدخال DNA الأجانب.

وقد أنشأت الكثير من العمل Electroporation للمن الأحماض النووية في خلايا الثدييات على حد سواء البكتيرية وكأسلوب مختبر مشترك؛ ومع ذلك، هناك أبحاث جارية حول أفضل الطرق لتقديم البروتينات في الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية. هي تقارير عن البروتين ترنسفكأيشن واعدة، ولكن تتطلب الكواشف مكلفة والتحسين. الرغبة في إدخال المستجيبات البكتيرية السامة إلى مجموعة واسعة من الأهداف خلية بأقل تكلفة ممكنة أدى بنا إلى النظر في Electroporation للكطريقة لدراسة هذه البروتينات في الجسم الحي.

بروتين ^23-25 ​​Electroporation للهو الوفاءهود لإدخال البروتينات في الخلايا الحية عبر electropermeabilization، المعروف أيضا باسم الكهربائية ترنسفكأيشن أو الكهربائية حقن ^26. وتستخدم هذه التقنية عالية الكثافة النبضات الكهربائية لخلق المسام في أغشية الخلايا. هذه المسام عكسها تسمح الجزيئات التي يتم استبعادها عادة من الفضاء داخل الخلايا لدخول الخلية. على إزالة الحقل الكهربائي الخارجي، لا يمكن للغشاء إعادة الختم، والسماح للخلية للاحتفاظ الجزيئات التي مرت من خلال المسام ^27،28.

تم استخدام electroporator القياسية في هذه الدراسة لتقديم باستمرار المستجيبات البكتيرية في كل من الماوس خلايا تشبه البلاعم والخلايا الظهارية الإنسان. طريقة سريعة وفعالة، وغير مكلفة، مع أي انخفاض ملموس في جدوى الخلوية. يمكن تصور البروتينات أدخلت عن طريق المناعي المجهري أو استخدامها لالمقايسات الفنية. وقد تجلى ذلك باستخدام بروتين الفلورية الخضراء (GFP) كمعيار غير سامة، وكذلكاثنين من السالمونيلا البروتينات المستجيب، SspH1 وGtgE. نقترح البروتين Electroporation للكأداة إضافية في جعبته لدراسة البروتينات الفوعة البكتيرية وظائفهم في الخلايا المضيفة حقيقية النواة.

Protocol

1. إعداد مقدما الفوسفات العقيمة الدافئة مخزنة المالحة (PBS) إلى 37 درجة مئوية. تعديل الدافئ Dulbecco ومتوسطة النسر (DMEM) والحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، و 100 وحدة د?…

Representative Results

كما دليلا الأولي للمفهوم، وقدم النقى البروتين الفلوري الأخضر بنجاح في خلايا الثدييات باستخدام Electroporation لل. هو عرض GFP، تقريبي 27 دينار كويتي بروتين الوزن الجزيئي عادة في خلايا الثدييات (معبرا عادة من DNA البلازميد) كأداة البيولوجيا الجزيئية الخلوية دون سمية كبيرة. وحضنت…

Discussion

وقد تطورت المستجيبات يفرز من البكتيريا المسببة للأمراض على العمل ضمن بيئة الخلية المضيفة، وبالتالي فإنه من المفيد لدراستها في الموقع الطبيعي داخل المضيف. إدخال مؤثرات محددة من الفائدة في الخلايا المضيفة تسمح للتفاعلات الممرض في استضافة ذات الصلة لدراستها في ع…

Materials

Material or Equipment	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Cellgro	25-050-Cl
0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes	Bio-Rad	165-2088
100% Methanol	Any	N/A	Flammable, Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Counting Apparatus – Hemocytometer or Coulter Counter	Beckman Coulter	Model Z1
Cell Culture Incubator	Any	N/A	Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C
Cell Culture Plastic	Any	N/A	Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman
Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM)	Cellgro	10-013	Warm to 37 °C
Electroporator	Bio-Rad	E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-016-CV
Fluorescent confocal microscope	Ziess	Model  LSM 710
Glass Bottom Dishes for Microscopy	Wilco Wells	HBSt-3522
HALT Protease Inhibitor Cocktail	Pierce	78430	Corrosive, Toxic
HeLa Cell Line	ATCC	ATCC CCL-2
LDS 4X Loading Buffer	Invitrogen	NP0007
Minimal Essential Medium (MEM)	Cellgro	10-010	Warm to 37 °C
Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent	Any	N/A
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-Cl
RAW 264.7 Cell line	ATCC	TIB-71
Primary Antibody Against Target of Interest	Any	N/A
Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore	Any	N/A
Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Chill to 4 °C
Sterile Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Warm to 37 °C
Streptavidin Agarose Resin Suspension	Pierce	20353
Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred)	Any	N/A
TCEP	Sigma-Aldrich	646547	Corrosive, Toxic
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8585	Irritant, Toxic