Électroporation d'effecteurs bactériens fonctionnels dans des cellules mammifères
Summary
Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.
Abstract
L'étude des interactions entre protéines dans le contexte de cellules vivantes peut générer des informations essentielles sur la localisation, la dynamique et partenaires d'interaction. Cette information est particulièrement utile dans le contexte des interactions hôte-pathogène. De nombreuses protéines de pathogènes fonctionnent dans des cellules hôtes dans une variété de telle sorte que, ce qui permet l'évasion du système immunitaire de l'hôte et la survie dans l'environnement intracellulaire. Pour étudier ces interactions hôte-pathogène cellulaires protéiques, plusieurs approches sont couramment utilisés, y compris: l'infection in vivo avec une souche exprimant une protéine marquée ou mutant, ou l'introduction de gènes de pathogènes par transfection ou transduction. Chacune de ces approches a ses avantages et ses inconvénients. Nous avons cherché un moyen d'introduire directement des protéines exogènes dans les cellules. L'électroporation est couramment utilisé pour introduire des acides nucléiques dans les cellules, mais a été plus rarement appliquée aux protéines bien que la base biophysique est exactement le même.Une électroporation standard a été utilisée pour introduire des effecteurs bactériens affinité marqué dans des cellules de mammifères. Cellules macrophages épithéliales humaines et de souris ont été cultivées par des méthodes traditionnelles, détachés, et placés dans 0,4 cm cuvettes d'électroporation écart avec une protéine bactérienne pathogène exogène d'intérêt (par exemple Salmonella Typhimurium GtgE). Après l'électroporation (0,3 kV) et une courte période de récupération (4 h), la protéine intracellulaire a été vérifiée par marquage par fluorescence de la protéine par l'intermédiaire de son marqueur d'affinité et en examinant la distribution spatiale et temporelle par microscopie confocale. La protéine a également été montré une électroporation pour être fonctionnel dans la cellule et capable de trafic intracellulaire correct et l'interaction protéine-protéine. Bien que les protéines exogènes ont tendance à se accumuler sur la surface des cellules, les échantillons ont électroporées fortes augmentations de la concentration intracellulaire effecteur par rapport à incubation seul. Le protocole est simple et assez rapide pour être fait dans apParallèle mode, permettant la caractérisation à haut débit de protéines pathogènes dans des cellules hôtes, y compris le ciblage et la fonction des protéines de virulence subcellulaire.
Introduction
De nombreuses bactéries Gram-négatives utilisent des systèmes de sécrétion spécialisés pour injecter des protéines liées à la virulence (appelés effecteurs) directement dans les cellules hôtes 1-5. Ces effecteurs ont une large gamme de fonctions biologiques, notamment: la suppression de l'immunité de l'hôte, des modifications cytosquelettiques, la modification du trafic intracellulaire et la signalisation, les changements transcriptionnels et des altérations de protéasome hôte 9.6. Les fonctions d'effecteurs certains sont connus, mais les cibles de l'hôte et de l'action biochimique (s) de nombreux autres restent à déterminer. En comparant de type sauvage et les infections bactériennes recombinantes est une approche valable pour étudier les mécanismes effecteurs de virulence intracellulaires, il est souvent avantageux d'introduire un effecteur individu dans la cellule hôte. Ainsi, des méthodes simples pour l'introduction et la caractérisation de protéines effectrices bactériennes dans le contexte de cellules hôtes est hautement souhaitable.
Simplifier l'analyse expérimentale wie un seul effecteur est essentiel que d'autres effecteurs peuvent avoir des fonctions opposées ou redondantes. Pour réaliser cette simplification, les chercheurs ont déjà présenté des macromolécules dans des cellules par de nombreux procédés différents, y compris la transduction virale 10, la micro-injection 11, gratter chargement 12,13, la fusion cellulaire avec la micro-injection induite chimiquement 14, protéine de propriété «transfection» réactifs 15, des précipitations de phosphate de calcium 16, 17 à 20 et l'électroporation. Les molécules introduites vont d'acides nucléiques, y compris les espèces de l'ADN, l'ARN, les protéines et d'ARNi, des colorants cellulaires imperméable, et des anticorps pour des cibles intracellulaires 21,22. Certaines méthodes ont des limites, y compris le type de macromolécule qui peut être introduite, et notamment des analyses en aval peuvent être limitées en raison de la toxicité élevée cellulaire, mécanismes dommageables d'action, faible efficacité, ou l'efficacité d'introduction. Transfection, un ofteProcédé de n-utilisée pour l'expression de gènes bactériens dans les cellules de mammifères, souffre également que la limitation de certains types de cellules hôtes appropriées, telles que les macrophages et les cellules primaires, sont particulièrement résistants à la transfection. Au-delà, il est difficile de contrôler les niveaux de protéine bactérienne produite lors de l'introduction de l'ADN étranger.
Beaucoup de travail a établi électroporation d'acides nucléiques dans les cellules bactériennes et de mammifères comme une technique de laboratoire commun; Cependant, il ya des recherches en cours sur les meilleures méthodes pour délivrer des protéines dans les cellules dans des conditions physiologiques. Rapports sur les protéines transfection sont prometteurs, mais nécessitent des réactifs coûteux et optimisation. Le désir d'introduire effecteurs bactériens potentiellement toxiques dans une grande variété de cibles cellulaires avec un coût minimal nous a conduit à envisager l'électroporation comme une méthode pour l'étude de ces protéines in vivo.
Protein électroporation 23-25 est une rencontreHod d'introduire des protéines dans des cellules vivantes par électroperméabilisation, aussi connu comme électro-transfection ou électro-injection 26. Cette technique utilise des impulsions à haute intensité de courant pour créer des pores dans les membranes cellulaires. Ces pores réversibles permettent macromolécules qui sont normalement exclues de l'espace intracellulaire d'entrer dans la cellule. Lors de l'enlèvement du champ électrique externe, la membrane peut refermer, permettant à la cellule de retenir les molécules qui sont passés à travers les pores 27,28.
Un électroporateur standard a été utilisé dans cette étude pour introduire systématiquement effecteurs bactériens dans les deux cellules de type macrophage souris et des cellules épithéliales humaines. La méthode est rapide, efficace et peu coûteux, sans diminution sensible de la viabilité cellulaire. Les protéines introduites peuvent être visualisées par microscopie d'immunofluorescence ou utilisés pour des tests fonctionnels. Cela a été démontré en utilisant la protéine fluorescente verte (GFP) en tant que norme non toxique, ainsi quedeux protéines effectrices Salmonella, SspH1 et GtgE. Nous proposons protéines électroporation comme un outil supplémentaire dans le répertoire pour l'étude des protéines de virulence bactérienne et leurs fonctions dans des cellules hôtes eucaryotes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effecteurs sécrétée par les bactéries pathogènes ont évolué pour fonctionner dans l'environnement de la cellule hôte et il est donc utile de les étudier in situ dans l'hôte. Introduction d'effecteurs spécifiques d'intérêt dans des cellules hôtes permet les interactions pathogène-hôte pertinentes à étudier dans l'isolement, sans interférence avec d'autres protéines bactériennes. Le but était d'explorer électroporation comme un moyen d'introduire des protéin…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.
Materials
| Material or Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus – Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
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