哺乳動物細胞への機能性細菌エフェクターのエレクトロポレーション
Summary
Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.
Abstract
生きた細胞の文脈におけるタンパク質相互作用の研究は、ローカリゼーション、ダイナミクス、相互作用パートナーに関する重要な情報を生成することができます。この情報は、宿主 – 病原体相互作用の文脈において特に価値がある。多くの病原体タンパク質は、細胞内環境内で宿主免疫系および生存の回避を可能にするような方法で、種々の宿主細胞内で機能する。タグ化または変異タンパク質、またはトランスフェクションまたは形質導入を介して病原体遺伝子の導入を発現する株によるインビボ感染これら病原体タンパク質の宿主細胞間相互作用を研究するために、いくつかのアプローチは、一般的に含め、使用されている。これらのアプローチの各々は、長所と短所がある。私たちは、直接細胞に外因性タンパク質を導入する手段を求めた。エレクトロポレーションは、一般的に細胞に核酸を導入するために使用されるが、生物物理学的根拠は全く同じであるが、それ以上のことはほとんどのタンパク質に適用されていない。標準的なエレクトロポレーターは、哺乳動物細胞への親和性タグ化細菌のエフェクターを導入するために使用した。ヒト上皮及びマウスマクロファージ細胞は、従来の方法により培養剥がし、目的の外来細菌性病原体タンパク質（ 例えば、ネズミチフス菌GTGE）と0.4cmのギャップエレクトロポレーションキュベットに入れた。電気穿孔法（0.3 kVの）および短い（4時間）の回復期間の後、細胞内タンパク質は、蛍光の親和性タグを介してタンパク質を標識し、共焦点顕微鏡によって空間的および時間的分布を調べることにより確認した。エレクトロポレーションしたタンパク質はまた、細胞内の機能的かつ正確な細胞内輸送およびタンパク質 – タンパク質相互作用が可能であることが示された。外因性タンパク質は、細胞の表面上に蓄積する傾向があったが、エレクトロポレーションサンプルは、単独でインキュベーション反応する細胞内エフェクター濃度相対の大きな増加があった。プロトコルはシンプルで、APで行われるのに十分に高速である病原性タンパク質の細胞内標的化および機能を含む、宿主細胞中の病原体タンパク質の高スループット特性評価を可能にarallelファッション。
Introduction
多くのグラム陰性細菌に直接、宿主細胞中に1-5（エフェクターと呼ばれる）病原性関連タンパク質を注入するために特殊な分泌系を使用する。宿主免疫の抑制、細胞骨格の変化、細胞内輸送およびシグナル伝達、転写変化の修正、およびホストプロテアソーム改変6-9：これらのエフェクターを含む広範囲の生物学的機能を有している。いくつかのエフェクターの機能は、しかし、ホスト·ターゲットおよび多くの他の生化学的作用（複数の）決定されていない、知られている。野生型および組換え細菌感染を比較する細胞内エフェクター病原性メカニズムを研究するための有効なアプローチであるが、それは、宿主細胞に個別のエフェクターを導入することが有利であることが多い。したがって、宿主細胞の文脈における細菌エフェクタータンパク質を導入し、特徴づけるための単純な方法が非常に望ましい。
実験的な分析のWiの簡素化単一エフェクターが重要な番目他のエフェクターは、対向または冗長機能を有していてもよいように。この単純化を達成するために、研究者は、以前にウイルス形質導入10、マイクロインジェクション11を含む多くの異なる方法によって細胞内に巨大分子を導入して、12,13のロードこすり、化学的に誘導されマイクロインジェクション14による細胞融合、独自のタンパク質「トランスフェクション」は、試薬15、リン酸カルシウム沈殿16、およびエレクトロポレーション17-20。導入された分子は、タンパク質、細胞不透過性色素、および細胞内ターゲット21,22のための抗体のDNA、RNA、およびRNAiの種を含む核酸の範囲である。いくつかの方法を導入することができる高分子の種類などの制限があり、特に、下流の分析は、高い細胞毒性、作用機序の損傷、低効力、または導入効率に制限されてもよい。トランスフェクション、ofte哺乳動物細胞中で細菌遺伝子を発現させるためのnに使用される方法は、また、マクロファージおよび初代細胞のようないくつかの関連する宿主細胞型は、トランスフェクションに向かって特に耐性であるという制約を受ける。これを超えて、それは、外来DNAの導入の際に生成細菌タンパク質のレベルを制御することは困難である。
多くの研究は、一般的な実験手法として、細菌および哺乳動物細胞の両方への核酸の電気穿孔法を確立した。しかし、生理的条件下で細胞内にタンパク質を送達するための最良の方法に進行中の研究がある。タンパク質のトランスフェクションに関する報告は有望であるが、高価な試薬及び最適化を必要とする。最小限のコストで細胞標的の多種多様な潜在的に有毒な細菌のエフェクターを導入する欲求は、生体内でこれらのタンパク質を研究するための方法として、エレクトロポレーションを検討するために私達を導いた。
タンパク質のエレクトロポレーション23-25 が満たされるまた、電気トランスフェクションまたは電気注射26として知られているelectropermeabilizationを経由して生きている細胞内にタンパク質を導入するHOD、。この技術は、細胞膜に細孔を作成するために高強度の電気パルスを使用する。これらの可逆細孔は、通常、細胞内空間から除外されている巨大分子が細胞を入力することができます。外部電界が除去されると、膜は、細胞は細孔27,28を通過した分子を保持することができ、再シールすることができる。
標準的なエレクトロは一貫マウスマクロファージ様細胞およびヒト上皮細胞の両方に細菌のエフェクターを導入するために本研究で使用した。この方法は、細胞の生存率のかなりの減少と、迅速、効率的、かつ安価である。導入されたタンパク質は、免疫蛍光顕微鏡で可視化または機能的アッセイのために使用することができる。これは同様に、非毒性基準として緑色蛍光タンパク質（GFP）を使用して実証されている2 サルモネラエフェクタータンパク質、SspH1とGTGE。私たちは、真核宿主細胞における細菌の病原性タンパク質とその機能の研究のためのレパートリーに追加のツールとしてタンパク質のエレクトロポレーションを提案する。
Protocol
Representative Results
Discussion
病原性細菌から分泌されたエフェクターは、宿主細胞環境内で機能するように進化してきたので、それは、宿主内で、その場でそれらを研究するために有用である。宿主細胞への関心の特定のエフェクターの導入は、関連する病原体 – 宿主相互作用は、他の細菌タンパク質からの干渉なしに孤立して研究することができるようになります。目標は、それによってトランスフェクション?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.
Materials
| Material or Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus – Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
Referenzen
- Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
- Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
- Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
- Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
- He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
- Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
- Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
- Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
- Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
- Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
- Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
- Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
- Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
- Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
- Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
- Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
- Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
- Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
- Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
- McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
- Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
- Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
- Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
- Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino … [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
- Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan … [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).
