Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em> Cryptococcus neoformans</em

Summary

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Abstract

Cryptococcosis ist eine lebensbedrohende Infektion, die von pathogenen Pilzen der Gattung Cryptococcus verursacht. Die Infektion erfolgt beim Einatmen von Sporen, die in der Lage, in die tiefe Lunge replizieren. Phagozytose von Cryptococcus durch Makrophagen ist eine der Möglichkeiten, dass die Krankheit in der Lage, in das zentrale Nervensystem verteilt, um letale Meningoenzephalitis führen. Daher ist die Lehre der Assoziation zwischen Cryptococcus und Makrophagen wichtig für das Verständnis des Fortschreitens der Infektion. Die vorliegende Studie beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll, um Makrophagen-Infektiosität von C. studieren neoformans in vitro. Mit diesem Protokoll wird die Rolle des Gastgebers Sterole auf Wirt-Pathogen-Interaktionen untersucht. Verschiedene Konzentrationen von Methyl – Cyclodextrin (MCD) wurden verwendet, um Cholesterin aus murinen Retikulum Sarkom Makrophagen-ähnlichen Zellinie J774A.1 abzureichern. Cholesterinabbau bestätigt und quantifiziert unter Verwendung sowohl einer handels verfügbe Cholesterinquantifizierung Kit und Dünnschicht-Chromatographie. Cholesterin verarmte Zellen wurden unter Verwendung Lipopolysacharide (LPS) und Interferon gamma (IFN & gamma;) aktiviert und mit Antikörper-opsonisiertes Cryptococcus neoformans Wildtyp H99 Zellen bei einem Effektor-zu-Ziel-Verhältnis von 1 infiziert: 1. Infizierte Zellen wurden nach 2 h Inkubation mit C. wachten neoformans und ihre phagozytische Index wurde berechnet. Cholesterinabbau führte zu einer signifikanten Reduktion der phagozytische Index. Die vorgestellten Protokolle bieten eine bequeme Methode, um die Einleitung des Infektionsprozesses in einer Laborumgebung nachzuahmen und Studium der Rolle von Wirtslipidzusammensetzung auf die Infektiosität.

Introduction

Phagozytose ist ein Prozess, durch den extrazellulären Instanzen durch Wirtszellen internalisiert. Es ist eine wichtige Waffe im Arsenal des Immunsystems, gegen Krankheitserreger zu verteidigen, aber der Prozess kann oft von Krankheitserregern unterlaufen werden, um für die Internalisierung und Verbreitung im ganzen Körper ¹ zu ermöglichen. Die Phagozytose wird durch mehrere Signalwege, die im Anhang und Einwirkung über Umlagerungen von Zytoskelett der Wirtszelle führen vermittelt. Professional "Phagocyten können sich auf der Oberfläche des eindringenden Pathogens erkennen und binden an Opsonine zur Anbringung und die Bildung der Lamellipodia, die den Krankheitserreger zu verschlingen und bilden eine phagosome ² zu signalisieren. Unter den so genannten "professionellen" Fresszellen sind Makrophagen. Makrophagen sind hoch spezialisierte Zellen, die durchführen, Schutzfunktionen, die die Suche nach und Beseitigung von Krankheitserregern, die Reparatur beschädigter Gewebe und Vermittlung Entzündung, die meisten schließendiese durch den Vorgang der Phagozytose ^1,2.

Cryptococcus neoformans ist eine Art von pathogenen Hefe, die eine schwere Krankheit wie Kryptokokkose bekannt verursacht. Cryptococcus Sporen werden durch den Host Einatmen und führen zu einer Lungeninfektion, die in der Regel asymptomatisch ist. Es wird vermutet, dass die Exposition ist extrem weit verbreitet; eine Stichprobe von 61 Kindern aus den Pediatric Infectious Diseases Clinic am Bronx-Lebanon Hospital Center stellte fest, dass alle Befragten hatten Antikörper gegen das Cryptococcus Polysaccharid glucuronoxylomannan und andere Studien haben Prävalenz sowohl in humanen Immundefizienz-Virus (HIV) infizierten und infizierten Erwachsenen ^{3 gezeigt, 4.} Alveolarmakrophagen sind in der ersten Zeile als Reaktion auf die Lungeninfektion und in den meisten Fällen erfolgreich klare Erregers. , Bei immungeschwächten Personen (zB HIV und AIDS-Patienten), die Hefe jedoch in der Lage, innerhalb der Makrophagen zu überleben. In diesenFällen können die Makrophagen als Nischen für die Replikation des Pathogens dienen und ihrer Weitergabe an das zentrale Nervensystem (ZNS), wobei die Krankheit tödlich ⁵ erleichtern ^{– 8.} Es wird vermutet, dass Makrophagen sogar die Hefe liefern direkt in die Hirnhäute und hilft, die Hefe, um die Blut-Hirnschranke über die "Trojanisches Pferd" Modell ^3,9 überqueren ^{– 11.} Somit ist es wichtig, den Prozess der Phagozytose und die Faktoren, die es beeinflussen, insbesondere in Kryptokokkeninfektionen verstehen.

Frühere Arbeiten in anderen Erreger-Systeme weisen auf Cholesterin und Lipid Rafts von Cholesterin eine wichtige Rolle bei der Phagozytose ¹² spielen gebildet ^{– 15.} Cholesterin ist die am häufigsten vorkommende Lipidspezies in Säugetierzellen und umfasst 25 – 50% der Säugerzelle Membran ^16. Es wurde festgestellt, um eine Rolle bei der Modulation der BioP spielenhysical Eigenschaften von Membranen durch Veränderung ihrer Steifigkeit ^17. Cholesterin und Sphingolipiden bilden Lipidmikrodomänen innerhalb der Membran als Lipid Rafts bekannt. Lipidflößen gefunden worden, um die Bildung von Caveolae, sowie Bereitstellen einer isolierten Domäne für bestimmte Typen von Signalisierungs ¹⁶ beteiligt ^{– 18.} Aufgrund ihrer geringen Größe, ist es schwierig, Lipidflößen in vivo zu studieren. Ein nützlicher Weg, um die Rolle von Lipidflößen zu untersuchen ist, um ihre Bestandteile zu verändern. Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) ist eine Verbindung, die gefunden wurde, um Cholesterin aus Säugetiermembranen führen und wird häufig verwendet, um die Rolle von Lipidflößen ¹⁸ zu studieren.

In diesem Protokoll wird eine Methode, um Cholesterin aus Wirtszellmembranen abzureichern und Quantifizierung der Wirkung der Abreicherung von der Fähigkeit der Wirtszellen, um C. phagozytieren neoformans in vitro. Dieses Verfahren macht Gebrauch von Zellkultur techniques auf einer immortalisierten Makrophagen-Zelllinie (J774A.1) als Modell für die Infektion. Cholesterinabbau durch Einwirkung MßCD, die einen hydrophoben Kern spezifisch an die Größe von Sterolen hat und in der Lage ist, um als Senke für Cholesterin, um es aus der Membran ¹⁹ zu ziehen handeln bewerkstelligt. Cholesterinabbau wurde quantitativ unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits und qualitativ mit einer modifizierten Bligh-Dyer Lipidextraktion, gefolgt von Dünnschichtchromatographie (TLC) ²⁰ gemessen. . ^{23 –} Phagozytose wurde durch Infizieren der Zelllinie mit einer Kultur der opsonisierten Hefe mit einem Cocktail von Interferon-γ und Lipopolysaccharid zur Aktivierung der Makrophagen gemischt gemessen Cryptococcus wurde mit einem glucuronoxylomannan (GXM) Antikörper ²¹ opsonisierten. Färbung und Mikroskopie Experimente zur Sichtbarmachung der Zellen und zur Berechnung der phagozytische Index erlaubt, den Grad der Phagozytose zu beurteilen. Zusammengenommen dieses Protokoll describes eine grundlegende Methode, die die Veränderung der Lipid-Zusammensetzung mit einem physiologischen Prozess integriert.

Protocol

1. Cholesterin Depletion von J774A.1 Zellen mit MßCD In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 5 J774A.1-Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Well auf einer 96-well-Zellkulturplatte in 200 ul Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S). Bei 37 ° C und 5% CO & sub2; O / N. Medium entfernt von der Zellmonoschicht und die Zellen werden zweimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PB…

Representative Results

Cholesterin Depletion Analyse des Überstands in Stufe 1.3 des Protokolls durch folgende Anweisungen des Herstellers im Amplex Red Cholesterol Assay Kit vorbehalten ergibt eine erhöhte Konzentration von Cholesterin in MßCD behandelten Probe im Vergleich zu der 1x PBS-Kontrolle. Je nach Zelltyp und MßCD Konzentration verwendet Cholesterinabbau kann variieren. Für J774 mit 10 mM MßCD behandelt wurde eine Abreicherung von ca. 50% beobachtet. Depletion kann mit aus dem Überstand und Zelllysat…

Discussion

Bei der Arbeit mit diesem Protokoll ist es wichtig, genaue Zellzählungen beim Plattieren Säugetierzellen und opsonisierenden C erhalten neoformans Zellen. Dies minimiert die Unterschiede zwischen Studien und gewährleistet eine exakte 1: 1-Ziel-Effektor-Verhältnis während der gesamten Studie. Es ist auch wichtig, um das Timing des Cholesterinabbau und Infektion zu koordinieren, um die opsonisierten Hefezellen oder behandelten Makrophagen aus ruhenden bei RT zwischen den Verfahren zu verhindern. Lan…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Class II type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	3460009
J774A.1 cell line	ATCC	TIB-67	Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus	Gibco	10082-147	Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Used to suplement DMEM
Isotemp Cell culture incubator	Fisher Scientific		Model # 3530
96-Well culture dish	Corning Inc. Costar	3595
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific BioReagents	BP3994	Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.
Methyl-β-Cyclodextrin	Sigma Life Science	C4555-10G	Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations
Orbital Shaker	Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit	Life Technologies Molecular Probes	A12216	All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.
96-Well Black Assay plate	Corning Inc. Costar	3603
FilterMax microplate reader	Molecular Devices		Model F5
TLC Chamber	Sigma-Aldrich	Z126195-1EA
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498-4L
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-2L-R
TLC Paper	Whatman	3030917	Cut down to size needed for TLC tank
Fume Hood			Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards
6-Well Plate	Corning Inc. Costar	3506
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Cell Scraper	Corning Inc. Costar	3010
Hemocytometer	Hausser Scientific	1490
Centrifuge	Beckman Coulter		Model Alegra x-30R
Votex Mixer	Fisher Scientific	12-812
Balance	Mettler Toledo		Model # MS104S Meaures down to .1 mg
Glass Pasteur Pipette	Fisherbrand	13-678-20A
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000
SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific		Model # SPD2010
Petroleum Ether	Fisher Scientific	E139-1
Diethyl Ether	Sigma-Aldrich	309966
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone	Analytical Chromatograhy Millipore	1.11845.0001
Iodine Chips	Sigma-Aldrich	376558-50G
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	320501
Manganese Chloride	Sigma-Aldrich	244589
UVP EC3 Imaging System	Ultra-Violet Products Ltd.		Use the Vision Works LS software for densitometry analysis
Glass Bottom Confocal Dish	MatTek	P35G-1.5-10C	www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)			Obtained from Duke University Medical Center
YNB	BD	239210	See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L.
Lipopolysaccharide	Sigma	L4391-1MG	Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C.
Interferon gamma	Sigma	I4777	Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)			Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL
Giemsa	MP Biomedicals	194591	Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.
Microscope	Zeiss		Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images