Photoactivated التعريب المجهري مع ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC-PALM)
Summary
Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.
Abstract
Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.
Introduction
تفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) هي الأساسية لعلم الأحياء 1 وينظم بإحكام عبر آليات الزمانية المكانية عبر العديد من جداول زمنية والطول. دراسات على الخلايا مما يدل على غشاء الخلية، على سبيل المثال، قد كشف، مقصورات المكانية النانو الحيوية التي تسهل مثبطات مضخة البروتون محددة والعمليات الخلوية 2. وبالتالي، فإن القدرة على تحقيق مثبطات مضخة البروتون في النظم البيولوجية لقرارات كافية المكانية والزمانية، خصوصية عالية، وحساسية عالية هو المفتاح لتحقيق فهم الآلية البيولوجيا.
ثنائي الجزيء مضان تكامل (BiFC) هي واحدة من عدد قليل من الأدوات الموجودة لتصور مثبطات مضخة البروتون في زنزانة مع قرار التحت خلوية والتوافق تعيش خلايا 3-5. هذه التقنية بسيطة نسبيا وتتضمن تقسيم البروتين مضان إلى قسمين شظايا غير الفلورسنت. عندما الموسومة راثيا لاثنين من البروتينات التفاعل وجلبت الى القرب، ويمكن أن شظايا بإعادة تشكيل لتشكيل بروتين فلوري كامل، مما أسفر عن إشارة الفلورسنت. عندما تكون مصممة بشكل صحيح، يجب تحقيقات BiFC لا إعادة تكوين تلقائيا في حالة عدم وجود مثبطات مضخة البروتون. على هذا النحو، فإن إشارة مضان في مقايسة BiFC تنشأ إلا في وجود مثبطات مضخة البروتون، والتي تمكن رؤية مباشرة من مثبطات مضخة البروتون مع خصوصية عالية. فوائد إضافية لاستخدام مضان كما قراءات هي حساسية عالية، وقرار التحت خلوية، والتوافق مع سرعة عالية وعالية المقايسات فحص المحتوى وغيرها. لهذه الفوائد، وقد وضعت عددا من تحقيقات BiFC على أساس مختلف البروتينات الفلورية الأم. كما هو الحال في جميع التقنيات الكشف الأخرى على أساس المجهر الضوئي التقليدية، ومع ذلك، فإن القرار المكانية من BiFC يقتصر على ~ 250 نانومتر من حيود الضوء. وهذا يجعل من التحدي لدراسة تنظيم مثبطات مضخة البروتون على مقياس النانو، والتي، كما ألمح في وقت سابق والتي تجسدت الطوافات الدهنية 6 لالثاني nanoclusters رأس 7، هو مقياس طول بالغ الأهمية لفهم العديد من العمليات الخلوية مثل الإشارات.
وقد تم الجمع بين BiFC مع photoactivated المجهر توطين (PALM) 8،9 للتغلب على هذا الحد في التحليل المكاني لتصوير مثبطات مضخة البروتون 10. PALM هو أسلوب superresolution المجهر الأخيرة التي تلتف حول الحد حيود في مجال التصوير مضان من خلال تفعيل العشوائية وتوطين subdiffractive من جزيئات الفلورسنت واحدة. في كل دورة التنشيط، جزيء فلوري تنبعث بضع مئات إلى بضعة آلاف من الفوتونات ويثير صورة جزيء واحد على كاشف. عندما تكون الصورة محدودة حيود (~ 250 نانومتر في العرض)، ويمكن تحديد النقطه الوسطى مع أعلى بكثير من الدقة، عادة في حدود 10-50 نانومتر اعتمادا على عدد من الفوتونات الكشف عنها. من خلال تفعيل وتوطين كل جزيء فلوري في العينة، يمكن إعادة بنائها على صورة عالية الدقة. Performeد على الخلايا الحية، جزيء واحد تتبع (smt-) PALM مزيد من تصاريح اقتناء الآلاف من مسارات البروتين نشرها من خلية واحدة (11). الأهم من ذلك، يستخدم PALM تحقيقات الفلورسنت المتخصصة مثل البروتينات الفلورية photoactivatable (PA-FPS) لتحقيق تفعيل مؤشر ستوكاستيك. لأن كلا BiFC وPALM البروتينات استخدام الفلورسنت، وكانوا جنبا إلى جنب عن طريق تقسيم PAmCherry1، وهي تستخدم عادة PA-FP لPALM، إلى قسمين شظايا بين الأحماض الأمينية 159 و 160.
نظام BiFC على أساس PAmCherry1 الانقسام يظهر إشارة خلفية منخفضة من إعادة عفوية من شظايا اثنين. عندما الموسومة راثيا لزوج من البروتينات التفاعل، شظايا اثنين (RN = بقايا 1-159؛ RC = الأرصاد + بقايا 160-236) أعيد بكفاءة لتشكيل البروتينات PAmCherry1 كاملة حتى عند 37 درجة مئوية وبدون يحتضنها عند انخفاض درجات الحرارة، والتي ليس هذا هو الحال للأزواج BiFC أخرى 12 مثل الوالد mCherry 13. Furthermoإعادة، والبروتين PAmCherry1 أعيد الاحتفاظ خصائص بالفوتونات من PAmCherry1 الأم، مثل نسبة عالية النقيض من ذلك، العائد الفوتون المتوسط، وتنشيط ضوئي سريع، من بين أمور أخرى، التي هي حيوية لدقيقة توطين جزيء واحد وعالية الدقة التصوير PALM.
في هذا البروتوكول، واستخدام BiFC-PALM لتصوير التفاعلات رأس راف في خلايا U2OS باستخدام PAmCherry1 تقسيم (الشكل 1A) يوصف. الخطوة الأولى هي لتصميم بنيات للتعبير عن البروتينات الانصهار بين شظايا PAmCherry1 (أي RN وRC) والبروتينات المثيرة للاهتمام. من الناحية النظرية، لكل زوج من البروتينات مرشح (A و B)، هناك ثمانية أزواج من البروتينات الانصهار لفحصها: RN-A / RC-B. RN-A / B-RC. RC-A / RN-B. RC-A / B-RN. A-RN / RC-B. A-RN / B-RC. A-RC / RN-B. وA-RC / B-RN. كثيرا ما يمكن تبسيط هذه العملية من خلال الأخذ بعين الاعتبار الخصائص الهيكلية أو البيوكيميائية للبروتينات مرشح. في حالة رأس، والبروتينبعد translationally تعديل المربع CAAX-C محطة (C = السيستئين؛ A = الأليفاتية، X = أي)، وبعد ذلك يتم المشقوق عزر AAX خارج. وبالتالي، RN أو RC لا يمكن إلا أن تنصهر إلى N-محطة رأس. وهذا يقلل من عدد من أزواج البروتين الانصهار إلى أربعة (الشكل 1B). لسلاح الجو الملكي البريطاني، المجال رأس ملزم (RBD، بقايا 51-131) يستخدم ويمكن الموسومة على حد سواء. تم إنشاؤها هذه التكوينات الانصهار أربعة: RN-KRAS / RC-راف RBD. RN-KRAS / راف RBD-RC. RC-KRAS / RN-راف RBD. وRC-KRAS / راف RBD-RN.
بالإضافة إلى ذلك، سوف رابط بين الشظايا والبروتينات ذات الاهتمام تحتاج إلى النظر فيها. وغالبا ما يستخدم رابط مرونة من حوالي عشرة الأحماض الأمينية، حيث أنه يوفر الحرية الكافية للتكامل تحدث. واحدة من هذه رابط هو (GGGGS) X2، على الرغم من أن هناك العديد من الآخرين التي تم تطبيقها بنجاح، بما في ذلك تسلسل عشوائي ولدت من موقع استنساخ متعددة (MCS) 14. قد تحتاج طول linkers أن يكون الأمثل dependinز على حجم البروتينات من الفائدة وتوجهاتها عند التعامل.
وترد شظايا PAmCherry1 في العمود الفقري استنساخ صغير مع المرافقة MCSS (انظر قائمة المواد). يمكن إدراج الجينات ذات الاهتمام عبر المواقع تقييد أو مع طريقة ربط مستقل. بعد استنساخ وتسلسل التحقق، يتم تحويل الكاسيت تعبر عن ناقلات التعبير باستخدام رد فعل recombinase، وهي عملية الاستنساخ مع الدقة العالية وكفاءة عالية.
بعد ذلك، و transfected بنيات التعبير مما أدى إلى خط الخلية المستهدفة، أو إذا كان المطلوب هو خط الخلية مستقرة، وتعبئتها في الفيروسة البطيئة لتصيب خط الخلية المستهدفة. ترنسفكأيشن عابر يسمح للمصادقة سريع للتكوينات BiFC، ولكن يجب أن يكون لاحظت المشاكل المحتملة. ترنسفكأيشن استخدام المواد الكيميائية غالبا ما يشدد الخلايا، مما أدى إلى تألق ذاتي عالية. في حين أن استخدام مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) microscoالحمر يمكن أن تخفف هذه إشارة الخلفية عن طريق الحد من حجم الإضاءة، TIRF مثالية عندما تأخذ مثبطات مضخة البروتون مكان على غشاء الخلية. بالإضافة إلى ذلك، transfections عابرة غالبا ما تؤدي إلى مستويات عالية من بروتين تعبير، تتجاوز بكثير تلك التي من البروتينات الذاتية، والتي قد تسبب القطع الأثرية في الكشف عن مثبطات مضخة البروتون. وبالتالي، فمن المستحسن أن يتم إنشاء خطوط الخلايا مستقرة بعد أن تم تحديد تكوين BiFC المناسب من خلال الاختبارات الأولية. لديها خطوط الخلايا مستقرة أيضا إمكانية للتعبير الانضباطي عبر الدوكسيسيكلين تحريض 15.
بعد الإصابة، يتم تحديد الخلايا مع المضادات الحيوية، وعادة بوروميسين والنيوميسين، واحد لكل بناء. وسيتم وصف الخطوات اللاحقة لإعداد العينات، والحصول على الصور، وتحليل البيانات بالتفصيل في البروتوكولات.
مع هذا النهج، لوحظ تشكيل مجموعات النانو في الصور BiFC النخيل من رأس راف RBD بشكل روتيني (الشكل 2A </ قوي>). باستمرار، مسارات SMT-PALM من رأس راف RBD تظهر التوزيع غير المتجانس في دول الانتشار (الشكل 2B-D). هذه النتائج تشير إلى أن المجمعات رأس راف موجودة في دول متعددة على غشاء الخلية، ويفترض كما أحادية والتجمعات، مع الآثار البيولوجية المحتملة. يوضح هذا العمل قوة BiFC النخيل في التصوير الانتقائي لمثبطات مضخة البروتون في الخلايا مع نانومتر القرار المكانية وحساسية جزيء واحد، والتي سيكون من الصعب الحصول مع BiFC التقليدية، مضان شارك في التعريب، أو مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق).
عند تصميم التجارب BiFC وتفسير النتائج، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن عملية BiFC لا رجعة فيه في معظم الحالات، بما في ذلك PAmCherry1 الانقسام. مرة واحدة شظايا اثنين والجمع بين لتشكل البروتين PAmCherry1 الكامل، والربط بين أجزاء اثنين، وبالتالي PPI يصبح دائم. وهذا يحد من استخدام BiFC وBiFC-PALM لرصد ديناميات مثبطات مضخة البروتون (أي حركية ملزم وليس ديناميكية انتشار مجمع البروتين فور تشكيلها)، وأحيانا يمكن أن تؤدي حتى إلى mislocalization من المجمعات PPI.
عاملا إضافيا في الاعتبار عند تصميم التجارب BiFC-PALM هو التأخير في النضج حامل اللون المتأصل في البروتينات الفلورية. مرة واحدة اثنين من البروتينات تتفاعل وشظايا FP معا، فإنها refold عادة بناء على أمر من ثانية (نصف الوقت من 60 ثانية لEYFP 3). ومع ذلك، لاحقا النضج حامل اللون وإشارة الفلورسنت تطوير بناء على أمر من دقيقة. في حين مضان قد يكون كشفها في غضون 10 دقيقة بعد إعادة تشكيل تقسيم الزهرة، وهي قابلة للطي بسرعة YFP البديل، والوقت غير الشقيق لنضج بشكل عام في كثير من الأحيان حوالي 60 دقيقة 16. ولوحظ انقسام PAmCherry1 لدينا أسعار مماثلة. وبالتالي، BiFC BiFC والنخيل وسوء الاختيارات حاليا لرصد الوقت الحقيقي حركية PPI. لي الآخرينthods، مثل الحنق وdimerization وضعت مؤخرا الفلورسنت تعتمد البروتين 17، قد تكون أكثر ملاءمة لهذا الغرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد BiFC أسلوب يستخدم عادة للكشف عن وتصور مثبطات مضخة البروتون في الخلايا، في حين PALM هو جزيء واحد superresolution تقنية المجهر الأخيرة التي تمكن التصوير النانو العينات البيولوجية سليمة. مزيج من BiFC مع PALM يتحقق التصوير الانتقائي لمثبطات مضخة البروتون داخل زنزانة مع نانومتر الق…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Steven Chu and Joe W. Gray for helpful discussions, Henry Marr for his initial work on the BiFC-PALM project, and Alexis Shoemaker for her technical assistance. This work is supported by startup funds to X.N. from OHSU. Research in the Nan laboratory was also supported by NIH 5U54CA143836-05, the Damon Runyon Cancer Research Foundation, the M. J. Murdock Charitable Trust, and the FEI company.
Materials
| TIRF Microscope | Nikon | ||
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | ||
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Coherent | ||
| 405 nm laser | Coherent | ||
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25×36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | |||
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 mL tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
Referenzen
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
- Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
- Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
- Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
- Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Coligan, J. E. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, 4D (2001).
- Morrison, S. L., Coligan, J. E., et al. Preparing frozen bacterial stocks. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3, Appendix 3M (2001).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
- Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
- Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).
