Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)
Summary
Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.
Abstract
Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.
Introduction
אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) הן יסוד לביולוגיה 1 ומוסדרות בחוזקה באמצעות מנגנוני חלל ובזמן על פני קשקשים רבים זמן ואורך. מחקרים על תא איתות על קרום התא, למשל, חשפו תאים דינמיים, ננו מרחבי המאפשרים PPIs ספציפי ותהליכים תאיים 2. לפיכך, היכולת לחקור PPIs במערכות ביולוגיות עם רזולוציות מספיק מרחב ובזמן, סגוליות גבוה, ורגישות גבוהה היא מפתח להשגת הבנת מכניסטית של ביולוגיה.
שלמת הקרינה bimolecular (BiFC) היא אחד הכלים הקיימים כמה חזותיים PPIs בתא עם רזולוציה subcellular ולחיות תאי תאימות 3 – 5. הטכניקה היא פשוטה יחסית וכרוך פיצול של חלבון הקרינה לשני שברים שאינם ניאון; כאשר גנטי מתויג לשני חלבוני אינטראקציה והביא לקרבה, שברים יכולים לשקם כדי ליצור חלבון פלואורסצנטי מלא, מניב אות ניאון. כאשר מתוכננים כראוי, בדיקות BiFC לא צריכים באופן ספונטני מחדש בהעדר של PPI. ככזה, אות הקרינה בassay BiFC תקום רק בנוכחות של PPI, המאפשרת הדמיה ישירה של PPI עם סגוליות גבוהות. יתרונות נוספים של שימוש בקרינה כקריאת הנתונים הם רגישות גבוהה, רזולוציה subcellular, ותאימות עם תפוקה גבוהה ומבחני מיון תוכן גבוהים, בין יתר. ליתרונות אלה, מספר בדיקות BiFC מבוססות על חלבוני ניאון ההורה שונים פותחו. כמו בכל שיטות לזיהוי אחרות המבוססות על מיקרוסקופ אור הרגילה, לעומת זאת, ברזולוציה מרחבית של BiFC מוגבלת ל~ 250 ננומטר על ידי העקיפה של אור. זה עושה את זה אתגר ללמוד הרגולציה של PPI בקנה המידה ננומטרי, אשר, כפי שרמז קודם לכן ושהודגם על ידי רפסודות שומנים 6ND nanoclusters ראס 7, הוא בקנה מידה אורך קריטי להבנה רבות תהליכים תאיים כגון איתות.
BiFC כבר בשילוב עם מיקרוסקופ photoactivated הלוקליזציה (PALM) 8,9 להתגבר מגבלה זו ברזולוציה מרחבית הדמיה PPIs 10. PALM הוא טכניקת מיקרוסקופיה superresolution האחרונה שעוקפת את מגבלת העקיפה בהדמיה הקרינה באמצעות הפעלה אקראית ולוקליזציה subdiffractive של מולקולות ניאון בודדות. בכל מחזור הפעלה, מולקולת ניאון פולטת כמה מאה לכמה אלף פוטונים ויוצרת תמונת מולקולה בודדת בגלאי. בעוד התמונה היא עקיפה מוגבל (~ 250 ננומטר ברוחב), centroid ניתן לקבוע בדייקנות גבוהה הרבה יותר, בדרך כלל בסדר הגודל של 10-50 ננומטר בהתאם למספר הפוטונים זוהו. על ידי הפעלה ואיתור כל מולקולת ניאון במדגם, ניתן לשחזר תמונה ברזולוציה גבוהה. Performeד על תאי חיים, רכישת רישיונות נוספים PALM יחיד מולקולת מעקב (smt-) אלפי מסלולי דיפוזיה החלבון מתא בודד 11. חשוב לציין, PALM משתמש בדיקות ניאון מיוחדות כגון חלבוני ניאון photoactivatable (PA-FPS) כדי להשיג הפעלה סטוכסטיים. מאחר ששני חלבוני ניאון השימוש PALM BiFC ו, הם אוחדו על ידי פיצול PAmCherry1, PA-FP נפוץ עבור PALM, לשני שברים בין חומצות אמינו 159 ו -160.
מערכת BiFC מבוססת על PAmCherry1 המפוצל מציגה אות רקע נמוכה מכינון מחדש ספונטני של שני ברים. כאשר גנטי מתויג לזוג חלבוני אינטראקציה, שני שברים (RN = שאריות 1-159; RC = Met + שאריות 160-236) מחדש ביעילות כדי ליצור חלבוני PAmCherry1 מלאים אפילו על 37 מעלות צלזיוס וללא דוגרים בטמפרטורות נמוכות יותר, ש זה לא המקרה לזוגות BiFC אחרים 12 כמו ההורה 13 mCherry. Furthermoמחדש, חלבון PAmCherry1 מחדש נשמרים מאפייני photophysical של PAmCherry1 ההורה, כגון יחס ניגודיות גבוה, תשואת פוטון בינונית, וphotoactivation המהיר, ביניהם קריטיים ללוקליזציה מדויקת מולקולה בודדת והדמיה PALM ברזולוציה גבוהה, אחרים.
בפרוטוקול זה, השימוש בBiFC-PALM הדמיה אינטראקציות ראס-רף בתאי U2OS באמצעות PAmCherry1 (איור 1 א) פיצול מתואר. הצעד הראשון הוא לעצב מבנים לביטוי חלבוני היתוך בין שברי PAmCherry1 (כלומר, RN וRC) והחלבונים של עניין. בתאוריה, לכל זוג של חלבוני מועמד (A ו- B), יש שמונה זוגות של חלבוני היתוך להיבדק: RN-/ RC-B; RN-A / B-RC; RC-/ RN-B; RC-A / B-RN; -RN / RC-B; -RN / B-RC; RC-/ RN-B; ו- RC / B-RN. תהליך זה לעתים קרובות יכול להיות פשוט יותר על ידי לקיחה בחשבון את המאפיינים המבניים או ביוכימיים של חלבוני המועמד. במקרה של ראס, החלבון הואלאחר translationally שונה בתיבת CAAX C-מסוף (C = Cys; = אליפטי; X = כל), לאחר שמוטיב AAX הוא ביקע את. לפיכך, RN או RC ניתן התמזגו רק לN-הסופית של ראס; זה מפחית את מספר זוגות חלבון היתוך לארבעה (איור 1). לרף, ראס מחייב תחום (RBD; שאריות 51-131) משמשת ויכולות להיות מתויגת בשני קצותיו. ארבע תצורות היתוך אלה שנוצרו: RN-KRAS / RC-רף RBD; RN-KRAS / רף RBD-RC; RC-KRAS / RN-רף RBD; וRC-KRAS / רף RBD-RN.
בנוסף, מקשר בין שברים והחלבונים של ריבית צריך להילקח בחשבון. מקשר גמיש של כעשר חומצות אמינו משמש לעתים קרובות כפי שהוא מספק חופש מספיק להשלמה להתרחש. מקשר אחד כזה הוא X2 (GGGGS), אם כי יש רבים אחרים שיושמו בהצלחה, כוללים רצפים אקראיים שנוצרו מאתר מרובה שיבוט (MCS) 14. אורכו של linkers ייתכן שיצטרך להיות מותאם תלויG בגודל של החלבונים של עניין והאוריינטציות שלהם באינטראקציה.
שברי PAmCherry1 כלולים בעמוד שדרת שיבוט קטן עם איגוף MCSs (ראה חומרי רשימה). הגנים של עניין יכולים להיות מוכנסים דרך אתרי הגבלה או עם שיטת קשירה-עצמאית. לאחר אימות שיבוט ורצף, קלטת הביטוי מועברת לוקטור ביטוי באמצעות תגובת recombinase, תהליך שיבוט עם איכות גבוהה ויעילות גבוהה.
בשלב הבא, בונה הביטוי וכתוצאה מכך הם transfected לתוך קו תא המטרה או, אם קו תא יציב הוא רצוי, ארוזה לlentivirus להדבקת קו תא המטרה. transfection החולף מאפשר אימות מהירה של תצורות BiFC, אבל בעיות פוטנציאליות חייבים לציין. Transfection שימוש בכימיקלים לעתים קרובות מדגיש את התאים, וכתוצאה מכך גבוה autofluorescence; בעוד שהשימוש בסך הקרינה השתקפות פנימית microsco (TIRF)py יכול למתן אות רקע זה על ידי הגבלת נפח התאורה, אידיאלי TIRF כאשר PPIs יתקיים בקרום התא. בנוסף, transfections החולף לעתים קרובות להוביל לרמות גבוהות של ביטוי חלבון, עלה בהרבה על אלה של חלבונים אנדוגניים, אשר עלול לגרום לחפצים באיתור PPIs. לפיכך, מומלץ כי תוקמנה שורות תאי יציבות לאחר תצורת BiFC מתאימה נקבעה באמצעות בדיקה ראשונית. יש גם שורות תאי יציבות הפוטנציאל לביטוי מתכונן באמצעות האינדוקציה דוקסיציקלין 15.
לאחר הדבקה, תאים נבחרים עם אנטיביוטיקה, בדרך כלל puromycin ונאומיצין, אחד לכל מבנה. השלבים הבאים להכנת מדגם, רכישת תמונה, וניתוח הנתונים שיפורט בהרחבה בפרוטוקולים.
עם גישה זו, ההיווצרות של אשכולות ננו בתמונות BiFC-כף ראס-רף RBD הם נצפו באופן שיגרתי (איור 2 א </ Strong>). באופן עקבי, מסלולי SMT-כף ראס-רף RBD להראות הפצה הטרוגנית במדינות דיפוזיה (איור 2-D). תוצאות אלו מצביעות על כך שמתחמי ראס-רף קיימים במדינות רבות בקרום התא, ככל הנראה כמונומרים ואשכולות, עם השלכות ביולוגיות פוטנציאליות. עבודה זו ממחישה את העצמה של BiFC-PALM בהדמיה סלקטיבית של PPI בתאים עם רזולוציה מרחבית ננומטר ורגישות מולקולה בודדת, שתהיה קשה להשיג עם BiFC הקונבנציונלי, שיתוף לוקליזציה הקרינה, או העברת תהודת הקרינה אנרגיה (סריג).
בעת תכנון ניסויי BiFC ולפרש את התוצאות, חשוב לזכור כי התהליך הוא בלתי הפיך BiFC ברוב המקרים, כולל PAmCherry1 פיצול. ברגע ששני שברים לשלב וליצור חלבון PAmCherry1 מלא, ההצמדה בין שני הברים, ובכך הופך PPI קבוע. זה מגביל את השימוש בBiFC וBiFC-PALM לניטור הדינמיקה של PPIs (כלומר, קינטיקה מחייבת ולא את דינמיקת דיפוזיה של החלבון המורכב ברגע שנוצר) ולעתים אף עלול להוביל לmislocalization של מתחמי PPI.
גורם נוסף שיש לשקול בעת תכנון ניסויי BiFC-PALM הוא העיכוב בהבשלת כרומופור שטבוע בחלבוני ניאון. ברגע ששני חלבוני אינטראקציה ושברי FP באים ביחד, הם בדרך כלל לקפל על סדר שניות (בחץ המשרה של 60 שניות לEYFP 3). עם זאת, התבגרות כרומופור הבאה ואות ניאון לפתח על סדר דקות. בעוד הקרינה עלולה להתגלות בתוך 10 דקות לאחר הכינון מחדש של מפוצל ונוס, גרסת YFP מהירה מתקפלת, בחץ המשרה להבשלה באופן כללי הוא לעתים קרובות סביב 60 דקות 16. מפוצל PAmCherry1 נצפה יש שיעור דומה. לפיכך, BiFC וBiFC-PALM הם בחירות עניות כיום לניטור קינטיקה PPI בזמן אמת; שלי אחרthods, כגון סריג וחלבון פלואורסצנטי התלוי dimerization שפותח לאחרונה 17, עשוי להיות מתאים יותר למטרה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiFC היה טכניקה נפוצות לאיתור וחזותי PPIs בתאים, ואילו PALM הוא הטכניקה האחרונה יחידה superresolution המולקולה מיקרוסקופית המאפשרת הדמיה בקנה מידה ננומטרי של דגימות ביולוגיות בשלמותה. השילוב של BiFC עם PALM השיג הדמיה סלקטיבית של PPI בתוך תא עם רזולוציה מרחבית ננומטר ורגישות מולקולה ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Steven Chu and Joe W. Gray for helpful discussions, Henry Marr for his initial work on the BiFC-PALM project, and Alexis Shoemaker for her technical assistance. This work is supported by startup funds to X.N. from OHSU. Research in the Nan laboratory was also supported by NIH 5U54CA143836-05, the Damon Runyon Cancer Research Foundation, the M. J. Murdock Charitable Trust, and the FEI company.
Materials
| TIRF Microscope | Nikon | ||
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | ||
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Coherent | ||
| 405 nm laser | Coherent | ||
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25×36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | |||
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 mL tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
Referenzen
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
- Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
- Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
- Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
- Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Coligan, J. E. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, 4D (2001).
- Morrison, S. L., Coligan, J. E., et al. Preparing frozen bacterial stocks. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3, Appendix 3M (2001).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
- Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
- Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).
