Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)
Summary
Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.
Abstract
Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.
Introduction
Protein-protein etkileşimleri (PPİ) biyoloji 1 için temel olan ve sıkı birçok zaman ve uzunluk ölçeklerinde genelinde zamanmekansal mekanizmalar üzerinden düzenlenir. Hücre zarı üzerinde hücre sinyal ile ilgili çalışmalar, örneğin, belirli bir PPIs ve hücresel süreçlerin 2 kolaylaştıran dinamik nano ölçekli mekansal bölmeleri göstermektedir. Bu nedenle, yeterli mekansal ve zamansal çözünürlükte, yüksek özgüllük ve yüksek hassasiyet ile biyolojik sistemlerde PPIs prob yeteneği biyoloji mekanistik anlayış ulaşmanın anahtarıdır.
5 – Bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) hücre içi çözünürlük ve canlı hücre uyumluluğu 3 bir hücreye PPIs görselleştirmek için birkaç mevcut araçlardan biridir. Tekniği oldukça basit ve iki floresan olmayan parçalara bir floresan proteininin yarma içerir; genetik iki etkileşen proteinlere etiketlendi zaman veyakınına getirildiğinde, fragmanları, flüoresan sinyali verecek şekilde tam bir floresan protein oluşturmak üzere sulandırmak olabilir. Doğru tasarlandığında, BiFC probları kendiliğinden PPİ yokluğunda sulandırmak gerekir. Bunun gibi, bir BiFC tahlilinde floresan sinyali sadece yüksek özgüllük ile PPİ doğrudan görüntülenmesine olanak tanıyan PPİ varlığında ortaya çıkacaktır. Okuma olarak floresan kullanmanın ek yararlar diğerleri arasında yüksek verimlilik ve yüksek içerik tarama deneyleri, yüksek hassasiyet, subsellüler çözünürlük ve uyumluluk. Bu faydalar, farklı üst floresan proteinleri göre BiFC probları bir dizi geliştirilmiştir. Geleneksel ışık mikroskopisi göre tüm diğer algılama teknikleri gibi, ancak, BiFC uzaysal çözünürlüğü ışık difraksiyonu ile ~ 250 nm ile sınırlıdır. Bu lipit sallar 6 a göre daha önce değindiğim ve örneklendiği gibi, nano, at PPİ düzenlenmesini incelemek için bunu bir meydan okuma yaparnd Ras nanokümeler 7, örneğin sinyalizasyon gibi birçok hücresel süreçleri anlamak için kritik bir uzunluk ölçektir.
BiFC PPIs 10 görüntülenmesi için mekansal çözünürlükte bu sınırı aşmak için fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) 8,9 ile kombine edilmiştir. PALM stokastik aktivasyonu ve tek flüoresan moleküllerinin subdiffractive lokalizasyonu ile floresan görüntüleme kırınım sınırı atlatır son superresolution mikroskopi tekniğidir. Her bir aktivasyon çevriminde, bir flüoresan molekül birkaç bin fotonlara birkaç yüz verir ve dedektör üzerinde tek bir molekülün bir görüntüye yol açmaktadır. Görüntü kırınım sınırlı olsa da (~ genişliği 250 nm) olarak, ağırlık merkezi, tipik olarak tespit edilen fotonların sayısına bağlı olarak 10-50 nm mertebesinde, daha yüksek hassasiyet ile tespit edilebilir. Aktive ve numunedeki her floresan molekülü lokalize ederek, yüksek çözünürlüklü bir görüntü yeniden inşa edilebilir. Performecanlı hücreler üzerinde d tek bir hücreden 11 protein difüzyon yörüngeleri binlerce tek bir molekül izleme (smt-) PALM ileri izin edinimi. Önemlisi, PALM stokastik aktivasyonunu elde etmek için bu tür ışıkla aktive floresan proteinleri (PA-FP) gibi özel flüoresan millerini kullanır. BiFC ve PALM kullanım floresan proteinleri hem beri onlar amino asitler 159 ve 160 arasında iki parça halinde, PALM için PAmCherry1, yaygın olarak kullanılan bir PA-FP bölerek kombine edilmiştir.
Bölünmüş PAmCherry1 dayalı BiFC sistemi iki parçalarının kendiliğinden sulandırıldıktan düşük arka plan sinyalini gösterir. Genetik olarak etkileşen proteinlerin bir çift etiketli, iki fragman (RN = 1-159 kalıntıları RC = Met + kalıntıları 160-236) da 37 ° C 'de ve daha düşük sıcaklıklarda kuluçkaya olmadan PAmCherry1 proteinleri oluşturmak için etkin bir şekilde yeniden, burada Böyle ebeveyn mCherry 13 gibi diğer BiFC çiftleri 12 için durum böyle değil. Furthermoyeniden yeniden PAmCherry1 proteini gibi doğru tek bir molekül lokalizasyonu ve yüksek çözünürlüklü PALM görüntüleme için kritik olan diğerleri arasında yüksek kontrast oranı, orta foton verimi ve hızlı fotoaktivasyon gibi ana PAmCherry1 ait Fotofiziksel özelliklerini korudu.
Bu protokolde, split PAmCherry1 (Şekil 1A) kullanarak U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntüleme için BiFC PALM kullanılması tarif edilmektedir. İlk adım PAmCherry1 fragmanları (örneğin, RN ve Re) ve ilgili proteinler arasındaki füzyon proteinleri ifade etmek için yapıları tasarlamaktır. Teorik olarak, aday protein (A ve B) her çifti için, füzyon proteinlerinin sekiz çifti, test edilecek vardır: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; ve A-RC / B-RN. Bu süreç genellikle dikkate aday proteinlerin yapısal veya biyokimyasal özellikleri alarak basitleştirilmiş olabilir. Ras'ın bir durumda, proteintranslasyon sonrası C-terminal CAAX kutusunun modifiye (C = Cys; A = alifatik, X = herhangi bir), ve bundan sonra AAX motifi kesilir. Bu nedenle, RN RC yalnızca Ras'ın N-terminine kaynaşmış olabilir; Bu dört (Şekil 1B), füzyon proteini çiftlerinin sayısını azaltır. Raf için domain Ras bağlayıcı (RBD; artıkları 51-131) kullanılır ve her iki uçta etiketlenmiş olabilir. Bu dört füzyon konfigürasyonları elde edilmiştir: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-Kras / RN-Raf RBD; ve RC-KRAS / Raf RBD-RN.
Buna ek olarak, fragmanlar ve ilgi proteinleri arasındaki bağlayıcı olarak kabul edilmesi gerekir. Yaklaşık on amino asit esnek bir bağlayıcı genellikle tamamlama oluşması için yeterli özgürlüğü sağlar olarak kullanılır. Çoklu bir klonlama bölgesinin (MCS) 14 elde edilen rasgele diziler dahil olmak üzere, başarılı bir şekilde uygulanmıştır diğerleri, olmasına rağmen böyle bir bağlayıcı (GGGGS) x2. Bağlayıcıların uzunluğu dependin optimize edilmesi gerekebilirilgi proteinlerin ve yönelimleri etkileşim boyutuna g.
PAmCherry1 fragmanları MCSS yan küçük bir klonlama omurgası içerdiği (Malzeme listesi). Söz konusu genler sınırlama siteleri yoluyla, ya da bir ligasyon bağımsız yöntemi ile yerleştirilebilir. Klonlama ve Sekans doğrulama sonrasında, ekspresyon kaseti, bir yeniden bağlayıcı reaksiyonlar, yüksek aslına uygunluk ve yüksek verimlilik ile bir klonlama işlemi kullanılarak bir ekspresyon vektörüne transfer edilir.
Daha sonra, elde edilen sentezleme konstruktları hedef hücre hattı enfekte etmek için sabit bir hücre serisi isteniyorsa, lentivirüs içine paketlenmiş, hedef hücre hattına transfekte veya edilir. Geçici transfeksiyon BiFC yapılandırmasının hızlı doğrulama için sağlar, ancak potansiyel problemler dikkat edilmelidir. Genellikle kimyasallar kullanarak Transfeksiyon yüksek otofloresans sonuçlanan hücreleri vurgular; ise toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobik kullanımıpy PPİ hücre zarındaki yer alırken aydınlatma hacmi, TIRF idealini sınırlayarak bu arka plan sinyalini azaltmak olabilir. Buna ek olarak, geçici nakiller genellikle çok PPIs saptanmasında eserler neden endojen proteinlerin aşan, protein ekspresyonunun yüksek seviyeleri yol açar. Bu nedenle, uygun bir BiFC yapılandırması ilk test ile belirlenmiştir sonra kararlı hücre soyları kurulmuştur önerilir. Stabil hücre hatları da doksisiklin indüksiyonu 15 vasıtasıyla ayarlanabilir ekspresyon için potansiyele sahiptir.
Enfeksiyondan sonra, hücreler tipik haliyle puromisin ve her bir yapı için neomisin, bir antibiyotik kullanılarak seçilir. Numune hazırlama, görüntü elde etme ve veri analizi için bir sonraki adım protokoller detaylı olarak tarif edilecektir.
Bu yaklaşımla, Ras-Raf RBD BiFC PALM görüntülerde nano kümelerin oluşumu rutin görülmektedir (Şekil 2A </ strong>). Sürekli, Ras-Raf RBD smt-PALM yörüngeleri difüzyon devletler (Şekil 2B-D) heterojen bir dağılım gösterir. Bu sonuçlar, Ras-Raf kompleksleri potansiyel biyolojik etkileri olan, muhtemelen monomerlerin ve kümeleri gibi, hücre zarı üzerinde birden fazla eyalette mevcut olduğunu göstermektedir. Bu çalışma, geleneksel BiFC, floresan co-lokalizasyon veya floresan rezonans enerji transferi (FRET) ile elde etmek zor olurdu nanometre uzamsal çözünürlük ve tek bir molekülün duyarlılık, hücrelerin içinde PPİ seçici görüntülenmesinde BiFC PALM gücünü gösteriyor.
BiFC deneyler tasarlama ve sonuçları yorumlama, bu BiFC süreci bölünmüş PAmCherry1 dahil çoğu durumda, geri dönüşümsüz akılda tutmak önemlidir. Iki parça bir araya ve tam bir PAmCherry1 protein, iki parça arasındaki bağlantı oluşturabilir ve sonra bu şekilde PPI kalıcı olur. Bu BiFC ve BiFC-PAL kullanımını sınırlamaktadırPPI dinamiklerini (örneğin, bağlayıcı bir kinetik olup oluşturulduğu bir kez protein kompleksinin difüzyon dinamikleri) izlenmesi için ve zaman zaman M da PPI komplekslerinin mislocalization yol açabilir.
BiFC PALM deney tasarlama floresan proteinleri doğasında vardır kromofor olgunlaşmasında gecikme olduğunda ek bir faktör dikkate. İki protein etkileşim ve FP fragmanları bir araya gelip, onlar genellikle saniye (EYFP 3 60 saniyelik yarı zamanlı) mertebesinde yeniden katlayın. Ancak, sonraki kromofor olgunlaşma ve flüoresan sinyal dakika mertebesinde gelişir. Floresan bölünmüş Venüs, hızlı bir katlama YFP varyant sulandırılmasından sonra 10 dakika içinde tespit edilebilir iken, genel olarak olgunlaşması için yarı-zamanı genellikle yaklaşık 60 dakika 16. Split-PAmCherry1 benzer fiyat bilgisi gözlendi. Dolayısıyla, BiFC ve BiFC PALM gerçek zamanlı ÜFE kinetiği izlemek için şu anda kötü seçimlerdir; Diğer meörneğin FRET ve yeni geliştirilmiş bir dimerizasyon bağlı floresan proteini 17 gibi thods, bu amaç için daha uygun olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM sağlam biyolojik örneklerin nano ölçekli sokulmuşlardır son tek bir molekül superresolution mikroskopi tekniği ise BiFC, tespit ve hücrelerde PPIs görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir teknik, olmuştur. PALM ile BiFC kombinasyonu nanometre mekansal çözünürlükte ve tek bir molekülün duyarlılığı ile bir hücrenin içinde PPİ seçici görüntüleme elde etti. BiFC PALM her iki tekniğin yararını uzanır ve bu çalışmada gösterildiği gibi, kendi ana hücresel bağlamda PPİ …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Steven Chu and Joe W. Gray for helpful discussions, Henry Marr for his initial work on the BiFC-PALM project, and Alexis Shoemaker for her technical assistance. This work is supported by startup funds to X.N. from OHSU. Research in the Nan laboratory was also supported by NIH 5U54CA143836-05, the Damon Runyon Cancer Research Foundation, the M. J. Murdock Charitable Trust, and the FEI company.
Materials
| TIRF Microscope | Nikon | ||
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | ||
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Coherent | ||
| 405 nm laser | Coherent | ||
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25×36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | |||
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 mL tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
Referenzen
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
- Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
- Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
- Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
- Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Coligan, J. E. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, 4D (2001).
- Morrison, S. L., Coligan, J. E., et al. Preparing frozen bacterial stocks. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3, Appendix 3M (2001).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
- Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
- Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).
