This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.
The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain’s global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.
L' imagerie par résonance magnétique fonctionnelle optogénétiques (ofMRI) est une nouvelle technique qui combine la résolution spatiale de haut champ IRMf avec la précision de la stimulation optogenetic 1-11,38, permettant la cartographie spécifique de type cellulaire des circuits neuronaux fonctionnels et leur dynamique dans l'ensemble cerveau. Optogenetics permet de types cellulaires spécifiques à cibler pour la stimulation par l'introduction de canaux de conductance trans-membranaires, appelées opsins sensibles à la lumière. Les éléments spécifiques de circuits neuronaux sont génétiquement modifiées pour exprimer ces canaux, ce qui permet la milliseconde calendrier modulation de l' activité dans le cerveau intact 1-15. IRMf fournit une méthode non-invasive de la détermination de la réponse dynamique globale du cerveau à la stimulation optogenetic des circuits neuronaux spécifiques grâce à la mesure du signal en oxygène du sang en fonction du niveau (BOLD) 16-18, qui fournit une mesure indirecte de l' activité neuronale.
La combinaison de ces deux techniques, appelée imagerie par résonance magnétique fonctionnelle optogenetic (ofMRI), est avantageuse par rapport à d'autres méthodes de l'activité cérébrale d'enregistrement au cours de la stimulation tels que électrophysiologie, car il peut fournir une vue de l'ensemble du cerveau à une résolution spatiale relativement élevée. Ceci permet à la détection d' une activité neuronale en réponse à une stimulation ciblée sur de grandes distances à partir du site de stimulation sans qu'il soit nécessaire pour l' implantation d'électrodes d'enregistrement invasives 1-11. ofMRI est avantageuse par rapport à la méthode plus traditionnelle d'effectuer la stimulation électrique pendant l' IRMf, qui peut recruter différents types de cellules à proximité de l'électrode et confondre l'influence causale de chaque population 19 ainsi. En outre, les électrodes utilisées pour la stimulation électrique et le courant généré peut produire des artefacts lors de l' IRM 20. En effet, ofMRI permet l'observation de l'influence sur l'activité globale du cerveau de la modulati spécifiquesur une grande variété de types de cellules par l'utilisation de techniques de ciblage génétique avancées telles que le système Cre-Lox chez des animaux transgéniques ou bien l'utilisation de promoteurs. contrôle optique combinatoire avec une surveillance du cerveau entier est possible avec ofMRI par l'utilisation de deux NPHR pour inhiber CHR2 et pour exciter des types cellulaires spécifiques. La boîte à outils de optogenetic disponibles pour une utilisation dans ofMRI améliore aussi rapidement au fil du temps avec l'introduction de opsins avec sensibilité à la lumière accrue ou une cinétique améliorée, des stabilisées opsins fonction de l'étape (de SSFOs) ou de opsins rouge décalé qui peut annuler l'exigence de la fibre implantée optique, permettant une stimulation non-invasive lors de l' imagerie 21. Ces possibilités ne sont pas disponibles avec la stimulation électrique.
Cependant, les artefacts de signal résultant de l' échauffement des tissus en raison de la livraison de la lumière dans le cerveau ont été rapportés 22, où a été montré la modification des temps de relaxation induite par la température pour produire pseufaire activation. Les chercheurs du spectacle ofMRI doivent donc être conscients de ce potentiel confondre. Avec la mise en place et des contrôles adéquats, le problème peut être résolu. Par ailleurs, relativement faible résolution temporelle consistant à mesurer la réponse hémodynamique à IRMf peut être un facteur limitant pour certaines applications de cette technique.
Ce protocole décrit tout d' abord la construction des implants de fibres optiques qui permet de fournir des longueurs d' onde spécifiques de la lumière profondément dans le cerveau in vivo. Le protocole décrit ensuite la livraison du vecteur viral opsin codant pour une région du cerveau précise en utilisant la chirurgie stéréotaxique. Suivant le protocole décrit le processus de l'ensemble du cerveau IRM fonctionnelle lors de la stimulation lumineuse simultanée. Enfin, le protocole décrit l'analyse des données de base des données acquises.
À noter, l'optogénétique décrit ici nécessite un implant chronique pour la livraison de la lumière. Cependant, les implants à fibres optiques sont stables et biocompatible, permettant le balayage longitudinal et l' investigation des circuits neuronaux sur une période de mois 23,24.
En résumé, la stimulation précise et la capacité de surveillance du cerveau entier de ofMRI sont des facteurs cruciaux pour faire ofMRI un outil puissant pour l'étude des connectomique du cerveau. En outre, il peut fournir un nouvel aperçu sur les mécanismes de maladies neurologiques 25 lorsqu'il est associé aux différents modèles animaux. En effet, ofMRI a été utilisé pour élucider l'activité de réseau de sous – régions de l' hippocampe distincts associés à des saisies 8. Par conséquent, les laboratoires intéressés à répondre aux questions des neurosciences au niveau des systèmes trouveront cette technique d'importance.
Mouvement du sujet lors de l'imagerie est une source importante d'artefact qui peut conduire à la corruption de données. assurer de manière appropriée l'animal sur le berceau d'imagerie peut minimiser ces artefacts comme on le maintien des niveaux d'anesthésie appropriés. Ici, nous avons utilisé l'isoflurane, mais anesthésiques alternatifs, tels que la médétomidine ou la kétamine et xylazine, devraient également être considérés. Cependant, les niveaux et les choix d'anesthésique peuvent influencer de nombreux paramètres dans le cerveau, y compris la réponse GRASSE 28. L' isoflurane peut provoquer des changements dans l' excitabilité neuronale 29. D' autres anesthésiques peuvent également affecter GABA inhibition synaptique 30. Ainsi, le choix de l'anesthésie est important lors de l'exécution ofMRI compte tenu de sa capacité d'influer sur l'activité neuronale. ofMRI en l'absence d'anesthésie est possible, mais peut être difficile à une augmentation de mouvement de l'animal, qui peut être réduit si l'animal est habitué; ces études se réveillent ofMRI ont déjà été réalisées unnd éviterait l'effet confusionnel de l' anesthésie sur le cerveau 9,10. Post-traitement des algorithmes de correction de mouvement peuvent être utilisés pour atténuer fortement les effets du mouvement. Plusieurs de ces méthodes existent, y compris l'inverse algorithme de Gauss-Newton employé dans ce protocole, ce qui minimise la somme des carrés fonction des coûts de l'image de référence et de l'image sous-correction. L'algorithme est utile car elle permet une correction de mouvement rapide et robuste, en utilisant une conception de plate – forme parallèle du GPU pour réduire les délais de traitement 27.
Pour la reconstruction de données dans ce protocole, le logiciel personnalisé écrit dans un environnement MATLAB a été utilisé pour la reconstruction du maillage en deux dimensions, où les échantillons en spirale sont reconstruits dans l' espace k en images quadrillées 31-33. les données de séries temporelles ont été générées en calculant le pour cent modulation du signal BOLD de chaque voxel par rapport à la période de référence ont été recueillies avant la stimulation. Voxels dont les séries chronologiques ont été synchronisée à des blocs de stimulation optogenetic d'une valeur de cohérence de 0,35 ou plus ont été définis comme des voxels activés; cette valeur de cohérence correspond à une valeur inférieure à 10 -9 P 8. Les valeurs de cohérence ont été calculées à l'amplitude de la transformée de Fourier à la fréquence de cycles de stimulation répétées divisé par les carrés de somme de toutes les composantes de fréquence 8,27. erreur de l'peut être contrôlé à l'aide de la correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples. D'autres méthodes d'analyse peuvent être utilisés, y compris les tests statistiques paramétriques tels que les modèles linéaires généraux (MLG). La méthode de cohérence exige une connaissance moins avant du FRH par rapport au modèle linéaire général classique. Par conséquent, il est avantageux lors de l'exploration des données en utilisant ofMRI. Cependant, la méthode de cohérence ne peut être utilisé pour les données avec des dessins de blocs ou sélectionné des dessins liés à l'événement avec un fixe interstimulus intervalle et ne peuvent être utilisées dans les données ofMRI avec d'autres événements related conçoit ou dessins mixtes. Par la suite, la modélisation dynamique de causalité (DCM) peut être utilisé pour analyser les interactions entre les régions cérébrales identifiées par ofMRI. DCM est une technique statistique bayésienne développé pour l' analyse de la connectivité fonctionnelle des réponses du système aux entrées expérimentales pendant IRMf 34.
préoccupations techniques supplémentaires pour les ofMRI sont discutés ici. Les implants peuvent être endommagés ou tombent, ce qui conduit à l'élimination de l'animal atteint de l'étude. chirurgies Re-implantation ne sont pas recommandés en raison de l'incertitude supplémentaire de cibler le même retour sur investissement dans la chirurgie d'implantation originale et en raison de problèmes de protection des animaux. En raison de la quantité importante de temps et les ressources investis dans chaque sujet animal, l'examen de la résistance du matériau est une préoccupation importante lors du choix d'un ciment dentaire adapté pour une utilisation dans les études ofMRI. La chirurgie d'implantation est un facteur critique pour maximiser la longévité du IMPLANt et sujet animal. Par exemple, faire en sorte que le crâne est sec avant d'appliquer le ciment dentaire et en plaçant une quantité suffisante de ciment autour de l'implant de virole en céramique peut assurer sur la stabilité de long mois potentiel chronologie de l'animal pendant l'étude. En outre, les conceptions de cages alternatives peuvent être explorées et discutées avec le centre de protection des animaux pour éviter des cages avec des sommets de fil de maintien de la nourriture et de l'eau qui dépassent souvent dans la cage et offrir des possibilités pour l'animal d'endommager l'implant. Fait important, le ciment dentaire doit être choisi avec soin pour réduire les artefacts d'imagerie et qui affectent les ciments alternatifs peuvent être testés par application sur un fantôme et l'imagerie dans un scanner avant de les utiliser dans des expériences sur des animaux. Essai et erreur avec divers ciments dentaires a montré que le ciment utilisé dans ce protocole donne relativement peu d'artefacts. Un autre défi technique dans l'exécution de ofMRI est la précision du placement de la fibre optique au ROI prévu, compte tenu de l'extremely faibles distances qui peuvent exister entre les noyaux 35 dans le cerveau. Après avoir terminé les chirurgies d'implantation, les analyses anatomiques T2 peuvent être utilisés pour déterminer le placement correct en superposant sur un atlas du cerveau. La compétence du chirurgien et de la pratique d'effectuer ces chirurgies peut améliorer les taux de placement corrects. La spécificité et l'expression du opsin au ROI prévu peuvent être vérifiées à l'issue de l'étude de perfuser l'animal et fixant le cerveau, en utilisant l'immunohistochimie ou la fluorescence endogène d'une protéine rapporteur marqué à l'opsine pour la visualisation. Ces protéines rapporteuses peuvent également être colocalisées avec d' autres protéines pour assurer que le opsine est exprimé dans les types de cellules neurales souhaitées 1,8,15,25. Comme mentionné précédemment, les artefacts peuvent survenir lors de l' exécution ofMRI en raison de l' échauffement des tissus de la livraison de lumière 22. Le chauffage des tissus provoque une modification des temps de relaxation, résultant en faux signal BOLD. Pour veiller à ce que cativation résultant de la stimulation lumineuse pendant ofMRI est pas due à cet artefact, les contrôles opsin négatifs doivent être effectués dans laquelle une solution saline injectée animaux ou des animaux injectés avec des vecteurs de contrôle fluorophores (comme AAV-CaMKIIa-EYFP) subissent ofMRI. En outre, la fibre seulement bien construit implants optiques avec une bonne efficacité de transmission de la lumière devraient être utilisés pour éliminer la nécessité d'utiliser des puissances laser élevées. Des études ont été réalisées ofMRI dans lequel fausse activation due à l' échauffement des tissus n'a pas été un problème 1,6-8,10,11.
En ce qui concerne le choix du vecteur pour introduire les gènes optogénétiques requis dans les neurones pour l'expression, les AAV ne sont pas connus pour provoquer des maladies chez l'homme et sont donc une option pratique, compte tenu du niveau de biosécurité inférieur requis pour utiliser ces agents (BSL-1). En outre, une multitude de noyaux de vecteurs AAV transporter emballés avec divers gènes optogénétiques en stock et avec plusieurs sérotypes. Le sérotype de AAV doit être choisi belon sur la cible de la population de cellules destinées à assurer des niveaux d'expression optimaux 36,37. Les lentivirus peuvent également être utilisés, mais exigent un niveau plus élevé de biosécurité. La période de temps requise pour une expression suffisante des gènes optogénétiques est variable en fonction du modèle animal spécifique utilisé, de l'AAV particulier utilisé et sur le paradigme expérimental spécifique. Dans ce protocole, les rats Sprague Dawley à l'âge de 11 semaines sont utilisées et les études optogénétiques commencent quatre à six semaines après l'injection de virus. Des souris transgéniques peuvent également être utilisées dans des études optogénétiques. Il est nécessaire d'effectuer des expériences pilotes pour déterminer la quantité de temps spécifique requis pour une expression suffisante des opsins. paradigmes de stimulation peut varier en fonction de l'opsine spécifique utilisé. Dans ce protocole, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP est utilisé et le paradigme de stimulation est de 20 sec sur / 40 sec off. Si vous utilisez un SSFO, le paradigme de stimulation varie parce que le SSFO exige seulement une brève impulsion de lumière pour être actionné puis une brève impulsion de lumière à une autre longueur d'onde pour mettre fin.
Une préoccupation essentielle supplémentaire lors de l'exécution ofMRI empêche les fuites de lumière à partir de l'interface de l'implant de la virole avec le câble de raccordement de fibre optique lors de la stimulation optogenetic pour empêcher un signal du cerveau de confusion provenant de la stimulation visuelle, même lorsque l'animal est anesthésié. Cônes de ruban électrique noir peuvent être utilisés pour bloquer la lumière des viroles et pour couvrir les yeux de l'animal. Fait important, les valeurs physiologiques , y compris expiratoire CO 2 et la température du corps du sujet doivent être bien entretenus pendant toute la durée de l'imagerie. CO expiratoire 2 doit être maintenue entre 3 – 4% et la température du corps à 37 ° C. En outre, les séquences de calage afin de réduire autant que possible l'inhomogénéité du champ magnétique avant le démarrage ofMRI balaye fortement détermine la qualité des données résultantes BOLD. Le contrôle de ces facteursest essentiel dans la production de données fiables ofMRI. Dans ce protocole, les lasers à SSAD sont utilisés comme source de lumière pour la stimulation optogenetic. Parce que la lumière laser est cohérente, plus qu'assez de puissance peut être facilement fournie par la fibre optique. sources de lumière LED couplées à la fibre optique sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux, mais présentent l'inconvénient d'une diminution de la puissance de transmission de la lumière. La source de lumière laser nécessite l'alignement à chaque câble de raccordement de fibre optique particulier, mais avec la pratique, l'alignement peut être réalisé en quelques secondes à quelques minutes.
Les applications futures de ofMRI comprennent l'utilisation de opsins prochaine génération tels que opsins rouge décalée pour permettre la stimulation non-invasive lors de l'imagerie. En outre, l'implantation de l'EEG compatible avec l'IRM ou des électrodes d'enregistrement semblables le long de l'implant à fibre optique pourrait permettre l'acquisition de données à haute résolution temporelle, en plus des données à haute résolution spatiale de l'IRM. ofMRI avec electrophysiolenregistrement ogi pourrait fournir des informations détaillées sur la connectivité fonctionnelle du cerveau. En résumé, la puissance de ofMRI pour surveiller l'ensemble du cerveau en réponse à la stimulation des populations de cellules spécifiques définies par l'identité génétique ou anatomique fait ofMRI un outil essentiel à utiliser dans l'étude des maladies neurologiques et des connectomique du cerveau en bonne santé.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.
7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
binocular biological microscope 40X-1000X | Amscope | B100 | |
laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
power meter, Si Sensor, 400-1100 nm | Thor Labs | PM121D | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
NanoFil 100uL syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock |