This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.
The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain’s global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.
Optogenética imágenes de resonancia magnética (ofMRI) es una nueva técnica que combina la resolución espacial de alto campo fMRI con la precisión de la estimulación optogenética 1-11,38, lo que permite la cartografía específica del tipo celular de los circuitos neuronales funcionales y su dinámica en el conjunto cerebro. Optogenética permite para determinados tipos de células a ser objeto de estimulación mediante la introducción de canales de conductancia transmembrana, llamados opsinas sensibles a la luz. Los elementos específicos de los circuitos neuronales se modifican genéticamente para expresar estos canales, lo que permite la modulación de milisegundos-escala de tiempo de actividad en el cerebro intacto 1-15. fMRI proporciona un método no invasivo de determinar la respuesta dinámica global de cerebro a la estimulación optogenética de circuitos neuronales específicos a través de la medición de la señal de sangre-oxígeno-dependiente del nivel de (BOLD) 16 a 18, que proporciona una medida indirecta de la actividad neuronal.
La combinación de estas dos técnicas, denominado optogenético imágenes de resonancia magnética (ofMRI), es ventajoso sobre otros métodos de grabación de la actividad del cerebro durante la estimulación como electrofisiología ya que puede proporcionar una vista de todo el cerebro a relativamente alta resolución espacial. Esto permite la detección de la actividad neuronal en respuesta a la estimulación dirigida a grandes distancias desde el sitio de estimulación sin la necesidad de implantación de electrodos de registro invasivos 1-11. ofMRI es ventajoso con respecto al método más tradicional de realizar la estimulación eléctrica durante fMRI, que puede reclutar diferentes tipos de células cerca del electrodo y por lo tanto confundir la influencia causal de cada población 19. Además, los electrodos utilizados para la estimulación eléctrica y la corriente generada puede producir artefactos durante la RM 20. De hecho, ofMRI permite la observación de la influencia en la actividad cerebral global desde el modulati específicaen de una amplia variedad de tipos de células a través del uso de técnicas avanzadas de modificación genética dirigida, como el sistema Cre-Lox en animales transgénicos o el uso de promotores. control óptico combinatoria con monitorización de todo el cerebro es posible con ofMRI mediante el uso de ambos NpHR para inhibir y ChR2 para excitar tipos de células específicos. El kit de herramientas optogenético disponibles para su uso en ofMRI también está mejorando rápidamente en el tiempo con la introducción de opsinas con una mayor sensibilidad a la luz o la mejora de la cinética, de opsinas función de paso estabilizados (SSFOs) o de opsinas desplazadas al rojo que puede negar la necesidad de fibra implantada la óptica, lo que permite la estimulación no invasiva durante la exploración 21. Estas posibilidades no están disponibles con la estimulación eléctrica.
Sin embargo, los artefactos de señal resultantes de calentamiento del tejido, debido a la entrega de luz en el cerebro se han notificado 22, donde la modificación inducida por la temperatura de los tiempos de relajación se ha demostrado que producen pseuhacer activación. Por lo tanto, los investigadores que realizan ofMRI deben ser conscientes de este potencial factor de confusión. Con la configuración y el control adecuados, el problema puede ser abordado. Además, relativamente baja resolución temporal de la medición de la respuesta hemodinámica en fMRI puede ser un factor limitante para ciertas aplicaciones de esta técnica.
Este protocolo describe primero la construcción de los implantes de fibra óptica que permiten la entrega de longitudes de onda específicas de la luz profundamente en el cerebro in vivo. El protocolo a continuación, describe la entrega del vector viral opsina que codifica para una región del cerebro precisa el uso de la cirugía estereotáctica. A continuación, el protocolo describe el proceso de resonancia magnética funcional de todo el cerebro durante la estimulación simultánea de luz. Finalmente, el protocolo describe el análisis de datos de base de los datos adquiridos.
Es de destacar que la optogenética descrito aquí requiere un implante crónico para suministro de luz. Sin embargo, los implantes de fibra óptica son estables y biocompatible, lo que permite la exploración longitudinal y la investigación de los circuitos neuronales durante un período de meses 23,24.
En resumen, la estimulación más precisa y la capacidad de vigilancia de todo el cerebro de ofMRI son factores cruciales en la toma de ofMRI una poderosa herramienta para el estudio de los conectómica del cerebro. Además, se puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de las enfermedades neurológicas 25 cuando junto con diferentes modelos animales. De hecho, ofMRI se ha utilizado para elucidar la actividad de red de subregiones del hipocampo distintos asociados con convulsiones 8. Por lo tanto, los laboratorios interesados en responder a las preguntas de la neurociencia sistemas de nivel encontrarán esta técnica de importancia.
El movimiento del sujeto cuando se toman imágenes es una fuente significativa de artefacto que puede conducir a la corrupción de datos. Apropiadamente asegurar el animal en la base de formación de imágenes puede minimizar tales artefactos como se mantenimiento de los niveles de anestesia apropiadas. En este caso, hemos utilizado isoflurano, pero anestésicos alternativos, tales como la medetomidina o ketamina y xilacina, también deben ser considerados. Sin embargo, los niveles y la elección del anestésico pueden influir en muchos parámetros en el cerebro, incluyendo la respuesta BOLD 28. El isoflurano puede causar cambios en la excitabilidad neuronal 29. Otros anestésicos también pueden afectar a la inhibición sináptica de GABA 30. Por lo tanto, la elección de la anestesia es importante cuando se realizan ofMRI dada su capacidad de afectar a la actividad neuronal. ofMRI en ausencia de anestesia es posible, pero puede ser difícil con el aumento de movimiento del animal, que puede ser reducido si el animal está habituado; anteriormente se han realizado estos estudios despierto ofMRI unand evitaría el efecto de confusión de la anestesia en el cerebro 9,10. Post-procesamiento de los algoritmos de corrección de movimiento se pueden utilizar para mitigar en gran medida los efectos del movimiento. Varios de estos métodos existen, incluyendo la inversa algoritmo de Gauss-Newton empleado en este protocolo, lo que minimiza la suma de los cuadrados función de coste de la imagen de referencia y la imagen en virtud de corrección. El algoritmo es útil, ya que permite la corrección de movimiento rápido y robusto, con un diseño de plataforma paralela de la GPU para reducir los tiempos de procesamiento 27.
Para la reconstrucción de datos en este protocolo, software escrito en un entorno de MATLAB se utiliza para la reconstrucción de cuadriculado de dos dimensiones, donde las muestras de espiral se reconstruyen en el espacio k en imágenes reticulares 31-33. series temporales de datos se generaron mediante el cálculo del porcentaje de modulación de la señal BOLD de cada voxel en relación con el período de referencia recogidos antes de la estimulación. Voxels cuyas series de tiempo se synchronized a bloques de estimulación optogenética con un valor coherencia de 0,35 o superior se definieron como los voxels activados; este valor corresponde a una coherencia de menos de 10 -9 valor de p 8. Valores de coherencia se calcularon como la magnitud de la transformada de Fourier en la frecuencia de los ciclos de estimulación repetida, dividido por los cuadrados de suma de todos los componentes de frecuencia de 8,27. familywise de error puede ser controlado utilizando la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Los métodos alternativos de análisis pueden ser usados, incluyendo pruebas estadísticas paramétricas como los modelos lineales generales (GLM). El método de la coherencia requiere menos conocimiento previo de la HRF en comparación con el modelo lineal general convencional. Por lo tanto, es ventajoso cuando la exploración de datos utilizando ofMRI. Sin embargo, el método de la coherencia sólo se puede utilizar para los datos con los diseños de bloques o seleccionado diseños relacionados con eventos con un intervalo inter fijo y no se puede usar en los datos ofMRI con otro evento-relaTed diseños o diseños mixtos. Posteriormente, el modelado causal dinámica (DCM) se puede utilizar para analizar las interacciones entre las regiones del cerebro identificados a través de ofMRI. DCM es una técnica estadística bayesiana desarrollado para el análisis de la conectividad funcional a partir de las respuestas del sistema a las entradas experimentales durante fMRI 34.
Aquí se discuten las preocupaciones técnicas adicionales para ofMRI. Los implantes pueden ser dañados o se caigan, lo que lleva a la eliminación del animal afectado del estudio. cirugías reimplantación no se recomiendan debido a la incertidumbre adicional de dirigir el mismo retorno de la inversión como en la cirugía de implantación original y debido a cuestiones de bienestar animal. Debido a la cantidad significativa de tiempo y recursos invertidos en cada sujeto animal, la consideración de la resistencia del material es una preocupación significativa cuando la elección de un cemento dental adecuado para su uso en estudios ofMRI. La cirugía de implantación es un factor crítico para maximizar la longevidad de la IMPlant y sujeto animal. Por ejemplo, asegurándose de que el cráneo esté seca antes de aplicar el cemento dental y la colocación de una cantidad adecuada de cemento alrededor del implante férula de cerámica puede garantizar la estabilidad de potencial de línea de tiempo de meses de duración del animal durante el estudio. Además, los diseños alternativos de la jaula pueden ser explorados y discutidos con la instalación de cuidado de animales local para evitar jaulas de alambre con las tapas que llevan a cabo la comida y el agua que a menudo sobresalen en la jaula y proporcionar oportunidades para que el animal dañar el implante. Es importante destacar que, el cemento dental deben ser elegidos cuidadosamente para reducir los artefactos que afectan de imágenes y cementos alternativos pueden ser probados por la aplicación sobre un fantasma y de formación de imágenes en un escáner antes de su uso en experimentos con animales. Ensayo y error con diferentes cementos dentales se ha demostrado que el cemento utilizado en este protocolo da relativamente pocos artefactos. Otro desafío técnico en la realización de ofMRI es la precisión de la colocación de la fibra óptica en el retorno de la inversión prevista, dado el extremely pequeñas distancias que pueden existir entre los núcleos en el cerebro 35. Después de completar las cirugías de implantación, las exploraciones anatómicas ponderadas en T2 se pueden utilizar para determinar la colocación correcta mediante la superposición sobre un atlas cerebral. La habilidad del cirujano y la práctica de realizar estas cirugías puede mejorar las tasas de colocación correctas. La especificidad y la expresión de la opsina en el retorno de la inversión prevista se pueden verificar en la conclusión del estudio de perfusión del animal y se fija el cerebro, mediante inmunohistoquímica o la fluorescencia endógena de una proteína indicadora etiquetados a la opsina para la visualización. Estas proteínas indicadoras también pueden ser colocalized con otras proteínas para asegurar que la opsina se expresa en los tipos de células neuronales deseadas 1,8,15,25. Como se mencionó anteriormente, los artefactos pueden surgir cuando se realiza ofMRI debido al calentamiento de los tejidos de suministro de luz 22. El calentamiento de los tejidos causa la modificación de los tiempos de relajación, lo que resulta en la señal BOLD falsa. Para asegurarse de que activación resultante de la estimulación de luz durante ofMRI no se debe a este artefacto, controles opsina-negativos se deben realizar en los que o bien solución salina inyectada animales o animales inyectados con vectores de control de fluoróforos (tales como AAV-CamKIIa-EYFP) experimentan ofMRI. Además, los implantes de fibra óptica solamente bien construido con una buena eficiencia de transmisión de la luz se deben utilizar para eliminar la necesidad de utilizar potencias de láser de alta. ofMRI estudios se han realizado en los que la activación falsa debido al calentamiento de los tejidos no ha sido un problema 1,6-8,10,11.
En cuanto a la elección del vector para introducir los genes en las neuronas optogenética requeridas para la expresión, AAV no se sabe que causan enfermedades en los seres humanos y por lo tanto son una opción conveniente, teniendo en cuenta el nivel de bioseguridad más baja necesaria para utilizar estos agentes (BSL-1). Además, una multitud de núcleos de vectores AAV llevar envasados con diferentes genes optogenética en stock y con múltiples serotipos. El serotipo de AAV debe ser elegido bobre la base de la población de células diana destinadas a garantizar los niveles de expresión óptimos 36,37. Los lentivirus también se pueden utilizar pero requieren un nivel de bioseguridad superior. El período de tiempo requerido para la expresión suficiente de los genes optogenética es variable dependiendo del modelo animal específico utilizado, en el AAV particular usado y en el paradigma experimental específico. En este protocolo, ratas Sprague Dawley de 11 semanas de edad se utilizan y los estudios comienzan optogenética cuatro a seis semanas después de la inyección de virus. Los ratones transgénicos se pueden utilizar también en estudios optogenética. Es necesario llevar a cabo experimentos piloto para determinar la cantidad específica de tiempo requerido para la expresión suficiente de las opsinas. paradigmas de estimulación pueden variar dependiendo de la opsina específico usado. En este protocolo, AAV5-CamKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP se utiliza y el paradigma de estimulación es de 20 segundos de encendido / apagado 40 seg. Si se utiliza un SSFO, el paradigma de estimulación variará debido a que el SSFO requiere sólo un breve pulso de luz para ser activated y luego de un breve pulso de luz en otra longitud de onda para ser terminado.
Una preocupación fundamental adicional al realizar ofMRI es la prevención de fugas de luz desde la interfaz implante casquillo con el cable de conexión de fibra óptica durante la estimulación optogenética para evitar una señal de confusión cerebral procedente de la estimulación visual, incluso cuando se anestesia el animal. Conos de cinta aislante negro se pueden utilizar para bloquear la luz de los casquillos y para cubrir los ojos del animal. Es importante destacar que los valores fisiológicos incluyendo espiratorio CO 2 y la temperatura corporal del sujeto deben mantenerse adecuadamente a lo largo de la duración de la formación de imágenes. CO espiratorio 2 debe mantenerse entre 3-4% y la temperatura corporal a 37 ° C. Además, las secuencias de compensación magnética para reducir lo más posible falta de homogeneidad como en el campo magnético antes de iniciar ofMRI escanea en gran medida determina la calidad de los datos BOLD resultantes. El control de estos factoreses crítico en la producción de datos fiables ofMRI. En este protocolo, el láser DPSS se utilizan como fuente de luz para la estimulación optogenética. Debido a que la luz láser es coherente, la potencia que se puede suministrar fácilmente a través de la fibra óptica. fuentes de luz LED junto a la fibra óptica están disponibles de proveedores comerciales, pero tienen la desventaja de potencia reducida de transmisión de la luz. La fuente de luz láser requiere la alineación de cada cable de conexión de fibra óptica particular, pero con la práctica, la alineación se puede lograr en cuestión de segundos a minutos.
Las futuras aplicaciones de ofMRI incluyen el uso de opsinas de próxima generación, como opsinas desplazadas al rojo para permitir la estimulación no invasiva durante la exploración. Además, la implantación de MRI compatible-EEG o electrodos de registro similares a lo largo con el implante de fibra óptica podría permitir la adquisición de datos de alta resolución temporal, además de los datos de alta resolución espacial de MRI. ofMRI con Electrophysiologyogical grabación podría proporcionar amplia información sobre la conectividad funcional del cerebro. En resumen, el poder de ofMRI para controlar todo el cerebro en respuesta a la estimulación de las poblaciones de células específicas definidas por identidad genética o anatómica hace ofMRI una herramienta crítica para utilizar en el estudio de enfermedades neurológicas y de las conectómica del cerebro sano.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.
7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
binocular biological microscope 40X-1000X | Amscope | B100 | |
laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
power meter, Si Sensor, 400-1100 nm | Thor Labs | PM121D | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
NanoFil 100uL syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock |