This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.
The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain’s global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.
Optogenetic la risonanza magnetica funzionale (ofMRI) è una tecnica innovativa che combina la risoluzione spaziale di alto campo fMRI con la precisione di stimolazione optogenetic 1-11,38, consentendo cella specifica di tipo mappatura dei circuiti neurali funzionali e la loro dinamica su tutto il territorio cervello. Optogenetics permette di tipi cellulari specifici per essere mirati per la stimolazione con l'introduzione di canali conduttanza transmembrana, chiamati opsins fotosensibili. Elementi specifici di circuiti neurali sono modificati geneticamente per esprimere questi canali, consentendo millisecondo-tempistica modulazione di attività nel cervello intatto 1-15. fMRI fornisce un metodo non invasivo per determinare risposta dinamica globale del cervello alla stimolazione optogenetic di circuiti neurali specifici attraverso la misurazione del segnale di ossigeno nel sangue livello-dipendente (BOLD) 16-18, che fornisce una misura indiretta dell'attività neuronale.
La combinazione di queste due tecniche, definito optogenetic risonanza magnetica funzionale (ofMRI), è vantaggioso rispetto ad altri metodi di attività cerebrale registrazione durante la stimolazione quali elettrofisiologia perché può fornire una vista dell'intero cervello relativamente elevata risoluzione spaziale. Questo consente il rilevamento dell'attività neuronale in risposta alla stimolazione mirata a grandi distanze dal sito di stimolazione senza la necessità di impianto di elettrodi di registrazione invasive 1-11. ofMRI è vantaggioso rispetto al metodo più tradizionale di eseguire la stimolazione elettrica durante fMRI, che può assumere diversi tipi di cellule vicino all'elettrodo e quindi confondere l'influenza causale di ogni popolazione 19. Inoltre, gli elettrodi utilizzati per la stimolazione elettrica e la corrente generata possono produrre manufatti durante l'imaging MR 20. Infatti, ofMRI consente l'osservazione della influenza sull'attività cerebrale globale dal modulati specificosu un'ampia varietà di tipi cellulari mediante l'uso di tecniche avanzate di targeting genetica come il sistema Cre-Lox in animali transgenici o l'uso di promotori. controllo ottico combinatoria con controllo tutto il cervello è possibile con ofMRI attraverso l'uso di entrambi NpHR per inibire e ChR2 per eccitare tipi cellulari specifici. Il toolkit optogenetic disponibili per l'uso in ofMRI è anche rapidamente migliorando nel tempo con l'introduzione di opsine con una maggiore sensibilità alla luce o cinetiche migliorati, di stabilizzati opsine funzione passo (SSFOs) o di opsine rosso-spostato che può negare l'esigenza di fibra impiantato ottica, consentendo la stimolazione non invasiva durante l'imaging 21. Queste possibilità non sono disponibili con stimolazione elettrica.
Tuttavia, artefatti segnale risultante dal riscaldamento del tessuto a causa di consegna luce nel cervello sono stati riportati 22, dove è stato dimostrato modificazioni temperatura indotta tempi di rilassamento per produrre pseufare attivazione. I ricercatori che svolgono ofMRI devono quindi essere consapevoli di questo potenziale confondente. Con la buona impostazione e controlli, il problema può essere affrontato. Inoltre, relativamente bassa risoluzione temporale di misurare la risposta emodinamica in fMRI può essere un fattore limitante per certe applicazioni di questa tecnica.
Questo protocollo prima descrive la costruzione degli impianti in fibra ottica che consentono un'erogazione di specifiche lunghezze d'onda della luce in profondità nel cervello in vivo. Il protocollo descrive quindi la consegna del vettore virale opsina-codifica per una regione precisa del cervello utilizzando la chirurgia stereotassica. Avanti il protocollo descrive il processo di tutto il cervello risonanza magnetica funzionale durante la stimolazione luce simultanea. Infine, il protocollo descrive l'analisi dei dati di base dei dati acquisiti.
Da segnalare la optogenetics qui descritto richiede un impianto cronico per la consegna della luce. Tuttavia, gli impianti in fibra ottica sono stabili e biocompatibile, consentendo una lettura longitudinale e ricerca di circuiti neurali in un periodo di mesi 23,24.
In sintesi, la stimolazione precisa e tutto il cervello capacità di monitoraggio ofMRI sono fattori determinanti nel fare ofMRI un potente strumento per lo studio delle connectomics del cervello. Inoltre, può favorire la comprensione romanzo sui meccanismi di malattie neurologiche 25 agganciati con differenti modelli animali. Infatti, ofMRI è stato utilizzato per chiarire l'attività di rete di sub-regioni dell'ippocampo distinti associati a crisi epilettiche 8. Pertanto, i laboratori interessati a rispondere a domande di neuroscienze sistemi di livello troveranno questa tecnica di importanza.
Movimento del soggetto durante l'imaging è una fonte significativa di manufatto che può portare alla corruzione dei dati. Opportunamente garantire l'animale sul supporto di imaging in grado di ridurre al minimo tali artefatti come sarà il mantenimento di adeguati livelli di anestesia. Qui, abbiamo usato isoflurano ma anestetici alternativi, come medetomidina o ketamina e xilazina, dovrebbe essere considerato. Tuttavia, i livelli e la scelta di anestetico possono influenzare molti parametri nel cervello, tra cui la risposta BOLD 28. Isoflurano può causare cambiamenti nel neuronale eccitabilità 29. Altri anestetici possono anche influenzare GABA inibizione sinaptica 30. Così, la scelta di anestesia è importante quando performing ofMRI data la sua capacità di influenzare l'attività neuronale. ofMRI in assenza di anestesia è possibile ma può essere difficile con maggiore movimento dall'animale, che può essere ridotto se l'animale è abituato; sono stati precedentemente eseguiti tali studi svegli ofMRI unND eviterebbe l'effetto confondente di anestesia sul cervello 9,10. Post-elaborazione algoritmi di correzione di movimento possono essere utilizzati per attenuare notevolmente gli effetti del moto. Molti di questi metodi esistono, compreso l'inverso algoritmo di Gauss-Newton impiegato in questo protocollo, che minimizza la somma dei quadrati funzione costo dell'immagine di riferimento e l'immagine sotto la correzione. L'algoritmo è utile perché permette la correzione del movimento veloce e robusto, con una progettazione della piattaforma parallela della GPU per ridurre i tempi di lavorazione 27.
Per la ricostruzione dei dati in questo protocollo, software scritto su misura in un ambiente MATLAB è stato utilizzato per la ricostruzione gridding bidimensionale, in cui i campioni a spirale sono ricostruiti in k-spazio in immagini a griglia 31-33. dati di serie temporali sono stati generati calcolando la modulazione percentuale del segnale BOLD di ogni voxel rispetto al periodo di riferimento raccolti prima della stimolazione. Voxel la cui serie temporali sono stati synsincronizzato alle blocchi di stimolazione optogenetic con un valore di coerenza di 0,35 o maggiore sono stati definiti come voxel attivati; questo valore coerenza corrisponde a meno di 10 -9 valore P 8. Valori di coerenza sono stati calcolati come l'ampiezza della trasformata di Fourier alla frequenza dei cicli di stimolazione ripetuti divisi dai quadrati somma di tutti i componenti di frequenza di 8,27. Errore di Familywise può essere controllato tramite la correzione di Bonferroni per confronti multipli. Metodi alternativi di analisi possono essere utilizzati, compresi i test statistici parametrici, come i modelli lineari generali (GLMS). Il metodo coerenza richiede meno prima conoscenza del HRF rispetto al modello lineare generale convenzionale. Pertanto, è vantaggioso quando esplorare dati utilizzando ofMRI. Tuttavia, il metodo di coerenza può essere utilizzato solo per i dati con disegni a blocchi o selezionato i disegni evento-correlati con un fisso interstimulus intervallo e non possono essere utilizzati nei dati ofMRI con altro evento-relaTed progetta o disegni misti. Successivamente, dinamica modelli causali (DCM) può essere utilizzato per analizzare interazioni tra regioni cerebrali identificate attraverso ofMRI. DCM è una tecnica statistica bayesiana sviluppata per l'analisi della connettività funzionale da risposte del sistema agli ingressi sperimentali durante fMRI 34.
Ulteriori problemi tecnici per ofMRI sono discussi qui. Gli impianti possono essere danneggiate o cadere, porta alla rimozione dell'animale colpito dallo studio. ambulatori re-impianto non sono raccomandati a causa dell'incertezza addizionale di colpire lo stesso ROI come nella chirurgia di impianto originale e causa di problemi di benessere degli animali. A causa della notevole quantità di tempo e risorse investire in ogni soggetto animale, considerazione della resistenza del materiale è un problema significativo quando si sceglie un cemento dentale adatto per l'uso in studi ofMRI. L'intervento chirurgico di impianto è un fattore critico nel massimizzare la longevità del implant e soggetti animali. Ad esempio, assicurando che il teschio sia asciutta prima di applicare il cemento dentale e ponendo una quantità adeguata di cemento intorno alla protesi puntale ceramico in grado di garantire la stabilità dei potenziali temporale mesi-lungo dell'animale nel corso dello studio. Inoltre, i disegni della gabbia alternative possono essere esplorati e discussi con la funzione di cura degli animali locale per evitare gabbie con cime di filo che tiene il cibo e l'acqua che spesso sporgono nella gabbia e fornire opportunità per l'animale di danneggiare l'impianto. È importante sottolineare che il cemento dentale deve essere scelto con cura per ridurre gli artefatti che influenzano l'imaging e cementi alternative possono essere testati con l'applicazione su un fantasma e di imaging in uno scanner prima dell'uso in esperimenti su animali. Tentativi ed errori con i vari cementi dentali ha dimostrato che il cemento utilizzato in questo protocollo dà relativamente pochi artefatti. Un'altra sfida tecnica nell'esecuzione ofMRI è l'accuratezza di posizionamento fibra ottica al ROI previsto, data la estremely piccole distanze che possono esistere tra i nuclei nel cervello 35. Dopo aver completato gli interventi chirurgici di impianto, le scansioni anatomiche T2 possono essere utilizzati per determinare il corretto posizionamento sovrapponendo su un atlante del cervello. L'abilità del chirurgo e pratica l'esecuzione di questi interventi può migliorare i tassi di collocamento corretti. La specificità e l'espressione del opsina al ROI previsto possono essere verificati a conclusione dello studio di perfusione l'animale e che fissa il cervello, tramite immunoistochimica o la fluorescenza endogena di un reporter di proteine tag al opsin per la visualizzazione. Queste proteine reporter possono anche essere colocalized con altre proteine per garantire che il opsin è espresso in tipi cellulari neuronali desiderati 1,8,15,25. Come accennato in precedenza, i manufatti possono sorgere quando si esegue ofMRI a causa del riscaldamento del tessuto dalla consegna di luce 22. Il riscaldamento dei tessuti provoca la modifica dei tempi di rilassamento, con conseguente falsa segnale BOLD. Per garantire che accoltiva- derivante dalla stimolazione luminosa durante ofMRI non è a causa di questo manufatto, controlli opsin-negativi devono essere eseguite in cui soluzione salina iniettata animali o animali iniettati con vettori di controllo fluoroforo (come AAV-CaMKIIa-EYFP) subiscono ofMRI. Inoltre, la fibra solo ben costruito impianti ottica con una buona efficienza della trasmissione della luce dovrebbe essere utilizzato per eliminare la necessità di utilizzare i poteri alti laser. studi ofMRI sono stati condotti in cui falsa attivazione a causa di riscaldamento dei tessuti, non è stato un problema 1,6-8,10,11.
Per quanto riguarda la scelta del vettore per introdurre i geni optogenetic richieste in neuroni per l'espressione, AAV non sono noti per causare malattie negli esseri umani e sono quindi una scelta conveniente, dato il livello di biosicurezza più basso necessario per utilizzare questi agenti (BSL-1). Inoltre, un gran numero di nuclei vettore trasportare AAV confezionati con vari geni optogenetic in magazzino e con più sierotipi. Il sierotipo di AAV deve essere scelto based sul target popolazione di cellule destinate a garantire livelli ottimali di espressione 36,37. Lentivirus possono anche essere usati ma richiedono un livello di biosicurezza superiore. Il periodo di tempo richiesto per sufficientemente espressione dei geni optogenetic è variabile a seconda del modello animale specifico utilizzato, dalla particolare AAV utilizzato e dalla specifica paradigma sperimentale. In questo protocollo, ratti Sprague Dawley a 11 settimane di età sono utilizzati e gli studi optogenetic cominciano da quattro a sei settimane dopo l'iniezione di virus. Topi transgenici possono essere utilizzati anche in studi optogenetic. È necessario eseguire esperimenti pilota per determinare la quantità di tempo richiesto per sufficientemente espressione dei opsins. paradigmi stimolazione può variare a seconda del opsin specifico utilizzato. In questo protocollo, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP viene utilizzato e il paradigma di stimolazione è di 20 sec on / off 40 sec. Se si utilizza un SSFO, il paradigma di stimolazione varia perché l'SSFO richiede solo un breve impulso di luce per essere acsere attivato e poi un breve impulso di luce ad un'altra lunghezza d'onda da terminare.
Un ulteriore preoccupazione critica durante l'esecuzione ofMRI impedisce dispersione di luce dall'interfaccia dell'impianto puntale con il cavo patch in fibra ottica durante la stimolazione optogenetic per evitare che un segnale di confusione cerebrale proveniente da stimolazione visiva, anche quando l'animale è anestetizzato. Coni di nastro isolante nero possono essere usati per bloccare la luce dei puntali e per coprire gli occhi dell'animale. Importante, valori fisiologici inclusi espiratorio CO 2 e la temperatura corporea del soggetto deve essere mantenuto correttamente per tutta la durata del imaging. CO espiratorio 2 deve essere compresa tra 3 – 4% e la temperatura corporea a 37 ° C. Inoltre, le sequenze di spessoramento a ridurre il più disomogeneità possibile nel campo magnetico prima di iniziare ofMRI scansiona notevolmente determina la qualità dei dati BOLD risultanti. Il controllo di questi fattoriè fondamentale nella produzione di dati affidabili ofMRI. In questo protocollo, i laser DPSS sono utilizzati come fonte di luce per la stimolazione optogenetic. Poiché la luce laser è coerente potenza più che sufficiente può essere facilmente fornita attraverso la fibra ottica. sorgenti LED accoppiati a fibre ottiche sono disponibili da fornitori commerciali, ma hanno lo svantaggio di una ridotta potenza di trasmissione della luce. La sorgente di luce laser richiede l'allineamento di ogni particolare cavo patch in fibra ottica, ma con la pratica, l'allineamento può essere realizzato in pochi secondi a minuti.
Le future applicazioni di ofMRI includono l'uso di opsine di prossima generazione, come opsine rosso-spostato per consentire la stimolazione non invasiva durante l'imaging. Inoltre, l'impianto di MRI compatibile EEG o elettrodi di registrazione simili lungo con l'impianto in fibra ottica potrebbe consentire l'acquisizione di dati ad alta risoluzione temporale oltre ai dati ad alta risoluzione spaziale di MRI. ofMRI con electrophysiolregistrazione ogical potrebbe fornire informazioni dettagliate sulla connettività funzionale del cervello. In sintesi, il potere di ofMRI per monitorare l'intero cervello in risposta alla stimolazione di popolazioni di cellule specifiche definite per identità genetica o anatomica rende ofMRI uno strumento fondamentale utilizzare nello studio delle malattie neurologiche e dei connectomics del cervello sano.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.
7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
binocular biological microscope 40X-1000X | Amscope | B100 | |
laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
power meter, Si Sensor, 400-1100 nm | Thor Labs | PM121D | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
NanoFil 100uL syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock |