وPCR الفحص دوبلكس الرقمي للوقت واحد الكمي ل<em> المعوية النيابة.</em> وما يرتبط بها من البراز-الإنسان HF183 علامة في المياه
Summary
توضح هذه المخطوطة فحص المزدوجة الرقمي PCR التي يمكن استخدامها لتحديد وقت واحد المعوية النيابة. وعلامات وراثية HF183 كمؤشرات للتلوث برازي العام والمرتبط الإنسان في المياه الترفيهية.
Abstract
توضح هذه المخطوطة على الوجهين الرقمي فحص PCR (EntHF183 dPCR) لتقدير وقت واحد من المعوية النيابة. والإنسان البرازية المصاحب علامة HF183. وEntHF183 دوبلكس dPCR (على النحو المشار إليه EntHF183 dPCR الآن فصاعدا) يستخدم فحص نفس التمهيدي والتحقيق متواليات كما نظرائه الكمي PCR (QPCR) الفردية المنشورة. وبالمثل، يتم اتباع نفس الإجراءات تنقية المياه واستخراج الحمض النووي كما يؤديها قبل QPCR قبل تشغيل dPCR. ومع ذلك، فإن الوجهين dPCR فحص لديها العديد من المزايا على المقايسات QPCR. الأهم من ذلك، فحص dPCR يلغي الحاجة لتشغيل منحنى القياسية، وبالتالي، فإن التحيز المرتبطة وتقلباته، من خلال القياس المباشر أهدافه. وبالإضافة إلى ذلك، في حين الوجهين (أي الكمي في وقت واحد) المعوية وHF183 في QPCR غالبا ما يؤدي إلى التقليل الشديد من هدف أقل وفرة في عينة، يوفر dPCR الكمي ثابت من كل من الأهداف، شحذلها كميا بشكل فردي أو في وقت واحد في نفس رد الفعل. فحص dPCR هي أيضا قادرة على تحمل تركيزات مثبط PCR التي 1-2 أوامر من حجم أعلى من تلك التي تحملها بواسطة QPCR. هذه المزايا تجعل الفحص EntHF183 dPCR جذابة بشكل خاص لأنه يوفر وقت واحد معلومات دقيقة وقابلة للتكرار في كل عام ويرتبط البشري التلوث البرازي في المياه البيئية دون الحاجة إلى تشغيل اثنين من المقايسات QPCR منفصلة. وعلى الرغم من مزاياه أكثر QPCR، والحد الكمي العلوي من فحص dPCR مع الأجهزة المتوفرة حاليا ما يقرب من أربعة أوامر من حجم أقل من ذلك الذي يتحقق عن طريق QPCR. ونتيجة لذلك، لا بد من تخفيف لقياس تركيزات عالية من الكائنات المستهدفة مثل تلك التي لوحظت عادة بعد تسرب مياه الصرف الصحي.
Introduction
وقد استخدمت الأساليب الكمية PCR (QPCR) على نطاق واسع لرصد نوعية المياه الترفيهية والميكروبية تطبيقات تتبع مصدر لأنها أسرع وأكثر مرونة ومحددة بالمقارنة مع الطرق التقليدية القائمة على الثقافة. ونتيجة لذلك، ينصح QPCR لتحقيق نتائج مراقبة المياه السريعة للمؤشرات البرازية العامة مثل المكورات المعوية النيابة. في وكالة حماية البيئة المائية الترفيهية تنقيح معايير الجودة 1. كما تم تطوير العديد من فحوصات QPCR والتحقق من صحتها لتحديد مصادر التلوث البرازي في المياه البيئية 2. ومن بين هذه المقايسات HF183 علامة هي من بين الأكثر استخداما لتحديد المصاحب الإنسان تلوث برازي 3.
ومع ذلك، النتائج QPCR وغالبا ما تكون متحيزة لأنها تعتمد على المنحنيات القياسية لتقدير. QPCR الكمي تركيزات غير معروفة الهدف في عينات من التحريف دورة تحديد قيمتها (الكلوروكوين) من ستانمنحنى المعيارية التي تصف وجود علاقة خطية بين الكلوروكوين وكمية لوغاريتمي من مجموعة من المعايير تخفيفه بشكل متسلسل. وبالتالي قد يكون الافتقار إلى المواد المرجعية القياسية موثوقة ومتسقة التحيز إلى حد كبير النتائج QPCR. وأظهرت الدراسات أن النتائج QPCR اختلفت قبل ما يقرب من نصف سجل باستخدام معايير من مختلف البائعين 4 وبنسبة 2 أضعاف باستخدام دفعات مختلفة من المعايير من نفس البائع 5.
PCR (dPCR) التكنولوجيا الرقمية يقيس عينة مجهولة عن طريق عد تردد من الايجابيات في عدد كبير من تقارير إنجاز المشروعات المصغرة التي تم إنشاؤها بواسطة تقسيم لQPCR بالجملة إلى الآلاف أو الملايين من نانولتر موحد أو ردود فعل بيكو لتر 6. ويشار إلى PCR بالقطيرات الرقمي (أي هذه المقالة) أو غرفة الرقمي PCR، على التوالي، إذا كان أقسام هي قطرات الماء في الزيت (أي هذه المقالة) أو دوائر صغيرة على رقاقة. وهناك تركيز العينة العالي يؤدي إلى وجود الحمض النووي الهدف(PCR بالتالي إيجابي) في نسبة أعلى من الجدران، علاقة يقترب من توزيع بواسون. على هذا النحو، يتم تسجيل النتائج الثنائية (إيجابية أو سلبية PCR)، ويستخدم تردد من قطرات الإيجابية لحساب تركيز عينة مجهولة مباشرة عن طريق بواسون التقريب، مما يلغي الحاجة لمنحنى القياسية كما هو الحال في QPCR.
هذا النوع من ثنائي الكمي PCR الرقمي يوفر مزايا إضافية خلال QPCR 7. بسبب تأخر التضخيم لا تزال تسفر عن PCR إيجابي، dPCR الكمي هو أكثر قوة ضد تثبيط الذي يقلل من كفاءة التضخيم. وبالمثل، لا يتأثر dPCR الكمي من التباين في القيم الكلوروكوين كما هو QPCR، مما يؤدي إلى دقة أعلى من dPCR مقارنة QPCR 8-10.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن عملية التقسيم يضمن كمية صغيرة جدا من الهدف الحمض النووي موجودة في كل قطرة، والتقليل من فعالية المنافسة الركيزة (خلال amplificatioن من الأهداف الحمض النووي مختلفة) التي هي العقبات المشتركة لتحقيق الطباعة على الوجهين (أي فحص يقيس وقت واحد هدفين DNA) في QPCR. على هذا النحو، سواء كان التشغيل في الوجهين أو البسيط (أي يقاس هدف واحد في فحص واحد) dPCR تنتج الكمي لا يمكن تمييزها تقريبا من كل من الأهداف 7،11.
الهدف من فحص PCR الرقمي (EntHF183 dPCR) الموضحة في هذه المقالة هو الحصول على القياس المباشر المتزامن لمؤشر البراز العام المعوية النيابة. وعلامة HF183-البراز البشري يرتبط مع تحسن الدقة، واستنساخ ومتانة ضد تثبيط مقارنة QPCR لها نظرائه. وقد استخدم هذا الاختبار بنجاح لقياس التلوث البرازي في المياه العذبة البيئة والمياه البحرية، ومختلف المواد البرازية 7، ولكن يمكن أيضا أن تطبق على أي أنواع أخرى من المياه ومياه الصرف الصحي. هذا الاختبار يحمل وعودا كبيرة لتحليل الرواسب أو التربة بسبب ذلكق التسامح عالية لكبت، ولكن مطلوب مزيد من التجارب بسبب تعقيدات المانع تمزج بين هذه الأنواع من العينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. أولا، خلط خليط الفحص يمكن أن يكون صعبا بسبب مزيج الرئيسي هو أكثر لزوجة من يمزج سيد QPCR التقليدية. vortexing لبسيط قد يؤدي إلى عدم كفاية الاختلاط، وهذا بدوره يؤدي إلى توزيع غير موحدة من قوالب الحمض النووي في خليط فحص وبعد ذلك ف?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20uL pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200uL pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E.faecalius genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalius and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
Referenzen
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
- Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
- Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
- Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
- Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
- Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
- Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
- Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583 (2013).
- Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).
