の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ<em>エンテロコッカス属。</em>およびWatersにおけるヒトの糞便関連HF183マーカー
Summary
この原稿は、同時に腸球菌属を定量することができる二重デジタルPCRアッセイ。レクリエーション水域における一般的な人間と関連糞便汚染の指標としてHF183遺伝子マーカーを説明しています。
Abstract
この原稿は、 エンテロコッカス属の同時定量。と人間の糞便関連HF183のマーカーのための二重デジタルPCRアッセイ（EntHF183 DPCR）について説明します。 EntHF183二重DPCR（ここに至ってEntHF183 DPCRと呼ぶ）アッセイは、その公開された個々の定量的PCR（定量PCR）カウンターパートと同じプライマーおよびプローブ配列を使用しています。同様に、前のqPCRに実行されるように、同じ水のろ過とDNA抽出手順はDPCRを実行する前に続いています。しかし、二重DPCRアッセイは定量PCRアッセイを上回るいくつかの利点を有します。最も重要なことは、DPCRアッセイは、そのターゲットの直接定量することにより、それ故に関連するバイアスとばらつきを標準曲線を実行しているとする必要がなくなります。定量PCR（ すなわち同時定量） エンテロコッカスとHF183を二重化しながら加えて、多くの場合、試料中にあまり豊富で、ターゲットの深刻な過小評価につながる、DPCRは、両方のターゲットの一貫性の定量化を提供し、研ぎます彼女は同じ反応で個別にまたは同時に定量しました。 DPCRアッセイはまた、qPCRにより許容されるものよりも1〜2桁であるPCRの阻害剤濃度を許容することができます。それは、同時に2つの別々のqPCRアッセイを実行するために必要とせずに、一般的および環境水における人間関連糞便汚染の両方で、正確で再現性の情報を提供するため、これらの利点は、EntHF183 DPCRアッセイは特に魅力的です。定量PCRを超えるその利点にもかかわらず、現在利用可能な機器とDPCRアッセイの上部定量限界は、定量PCRによって達成可能なものよりも大きさの約4桁低いです。このため、希釈は、通常、汚水の流出後に観察されるような標的生物の高濃度の測定のために必要とされます。
Introduction
それらは伝統的な培養ベースの方法に比べてより速く、より柔軟かつ特異的であるため、定量的PCR（定量PCR）法が広く娯楽水質監視及び微生物源追跡用途に使用されてきました。その結果、定量PCRは、 エンテロコッカス属などの一般的な糞便指標の急速な水のモニタリング結果を達成するために推奨されている。改訂USEPAレクリエーション水質基準1で。多くのqPCRアッセイはまた、環境水2に糞便汚染の発生源を特定するために開発および検証されてきました。これらの中でも、HF183マーカーアッセイは、最も頻繁に人間関連糞便汚染3を識別するために使用される一つです。
彼らは定量化のための標準曲線に依存しているためしかし、定量PCRの結果は、多くの場合、バイアスすることができます。定量PCRはスタンから、その定量化サイクル（CQ）を補間することによって、サンプル中の標的の未知の濃度を定量化CQと直列に希釈した標準のセットの対数量との間の線形関係を記述する準の曲線。信頼性と一貫性標準物質の欠如は、したがって、大幅に定量PCRの結果にバイアスをかけることができます。研究は、定量PCRの結果は、異なるベンダー4と同じベンダ5から規格の異なるバッチを使用して、2倍から標準を使用して約半分のログによって異なっていることを示しました。
デジタルPCR（DPCR）技術は、均一なナノリットルまたはピコリットルの反応6の数千または数百万へのバルク定量PCRを分割することによって生成されたミニチュアPCRの大量に陽性の頻度をカウントすることにより、未知試料を定量化します。パーティションは油中水型液滴（ すなわち 、この記事）、またはチップ上の小室であるかどうかは、それぞれ（ すなわち 、この記事）液滴デジタルPCRまたはチャンバデジタルPCR、と呼ばれています。より高い試料濃度は、標的DNAの存在をもたらしますパーティションの高い割合で（したがって、正PCR）、ポアソン分布で近似関係。このように、バイナリ結果（正または負PCR）が記録され、正の液滴の周波数は、定量PCRのような標準曲線のための必要性を排除し、直接ポアソン近似を介して未知試料の濃度を計算するために使用されます。
デジタルPCR定量のこのバイナリ性質は定量PCR 7の上に付加的な利点を提供します。遅延増幅がまだ正のPCRを得ることができるので、DPCR定量は、増幅効率を低下させる阻害に対してよりロバストです。定量PCR 8-10と比較して、DPCRの高精度化につながる、定量PCRである同様に、DPCRの定量化は、Cqの値の変動による影響を受けません。
また、分割処理を効果的amplificatio中（基質競合を最小化する、各小滴中の標的DNAの存在の非常に少量を保証します定量PCR（ すなわちアッセイは、同時に2つのDNA標的を測定）の二重化を実現するための共通の障害となっている別のDNA標的）のn個。このように、二重またはシンプレックスで実行が（ つまり、一つのターゲットは、単一のアッセイで測定された）かどうかDPCRは、両方のターゲット7,11のほとんど区別できなく定量化を生成します。
この記事で説明したデジタルPCRアッセイ（EntHF183 DPCR）の目標は、一般的な糞便指標腸球菌属の同時直接定量を得ることである。そして改善された精度、再現性および阻害に対するロバスト性を有するヒト、糞便関連HF183マーカーは、その定量PCRと比較します対応。このアッセイは、正常な環境淡水、海水、および種々の糞便物質7の糞便汚染を定量するために使用されているだけでなく、水と廃水の任意の他のタイプに適用することができます。このアッセイは、原因それに堆積物や土壌を分析するための非常に有望ですsの阻害に対する高い耐性が、は更なる試験があるため、サンプルのこれらのタイプの中の阻害剤混合物の複雑さが要求されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルのいくつかの重要なステップがあります。マスターミックスは、従来の定量PCRマスターミックスよりも粘性であるため、まず、アッセイ混合物の混合が困難な場合があります。単純なボルテックスは、次に、アッセイ混合物中で、その後、液滴にDNA鋳型の不均一な分布をもたらす不十分な混合をもたらすことができます。プロトコールに記載ミキシング・バイ・ピペット操作技術?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20uL pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200uL pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E.faecalius genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalius and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
Referenzen
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