Un ensayo de PCR digital de dos vías para la cuantificación simultánea de la<em> Enterococcus spp.</em> Y el marcador asociado HF183-fecal humana en las aguas
Summary
Este manuscrito describe un ensayo de teléfono digital de dos PCR que se puede utilizar para cuantificar simultáneamente Enterococcus spp. Y los marcadores genéticos HF183 como indicadores de contaminación fecal general y asociada a humanos en aguas de recreo.
Abstract
Este manuscrito describe un ensayo de PCR duplex digitales (EntHF183 dPCR) para la cuantificación simultánea de Enterococcus spp. Y el marcador HF183-fecal asociada humano. El EntHF183 dúplex dPCR (denominado en adelante como EntHF183 dPCR) ensayo utiliza las mismas secuencias de cebadores y sondas como sus homólogos individuales publicados por PCR cuantitativa (qPCR). Del mismo modo, las mismas de filtración de agua y extracción de ADN procedimientos que se realiza antes de la qPCR se siguen antes de ejecutar dPCR. Sin embargo, el ensayo dPCR duplex tiene varias ventajas sobre los ensayos de qPCR. Lo más importante, el ensayo dPCR elimina la necesidad para el funcionamiento de una curva estándar y, por tanto, el sesgo y la variabilidad asociada, mediante la cuantificación directa de sus objetivos. Además, mientras que a doble cara (es decir, la cuantificación simultánea) Enterococcus y HF183 en qPCR a menudo conduce a una subestimación grave del objetivo menos abundantes en una muestra, dPCR proporciona cuantificación coherente de ambos objetivos, amolasu cuantificó individualmente o simultáneamente en la misma reacción. El ensayo dPCR también es capaz de tolerar concentraciones de inhibidor de PCR que son de uno a dos órdenes de magnitud mayores que las toleradas por qPCR. Estas ventajas hacen que el ensayo EntHF183 dPCR particularmente atractivo, ya que al mismo tiempo proporciona información precisa y repetible en tanto la contaminación fecal general y asociada humano en aguas ambientales sin la necesidad de ejecutar dos ensayos de qPCR separadas. A pesar de sus ventajas sobre qPCR, el límite de cuantificación superior del ensayo dPCR con instrumentación disponible actualmente es de aproximadamente cuatro órdenes de magnitud más baja que la que puede conseguirse por qPCR. En consecuencia, se necesita dilución para la medición de altas concentraciones de organismos diana tales como los observados típicamente siguiente derrames de aguas residuales.
Introduction
Los métodos cuantitativos de PCR (qPCR) han sido ampliamente utilizados para el seguimiento de recreo calidad del agua y aplicaciones de seguimiento de fuente microbiana porque son más rápidos, más flexible y específica en comparación con los métodos tradicionales basadas en el cultivo. En consecuencia, la qPCR se recomienda para lograr rápidos resultados de monitoreo de aguas fecales para los indicadores generales, tales como Enterococcus spp., En los criterios de calidad del agua recreativa USEPA 1 revisado. Muchos ensayos de qPCR también se han desarrollado y validado para la identificación de las fuentes de contaminación fecal en las aguas ambientales 2. Entre estos, los ensayos de marcadores HF183 se encuentran entre los más utilizados para la identificación de la contaminación fecal humana asociada-3.
Sin embargo, los resultados qPCR a menudo pueden estar sesgados porque se basan en las curvas de calibración para la cuantificación. qPCR cuantifica concentraciones desconocidas de diana en las muestras por interpolación de su ciclo de cuantificación (CQ) de un stancurva Dard que describe una relación lineal entre Cq y cantidad logarítmica de un conjunto de patrones diluidos en serie. Por lo tanto, la falta de material de referencia estándar fiable y consistente puede sesgar en gran medida los resultados qPCR. Los estudios demostraron que qPCR resultados diferían usando patrones de aproximadamente la mitad de un registro de diferentes proveedores 4 y 2 veces usando diferentes lotes de normas del mismo vendedor 5.
La tecnología digital de PCR (dPCR) cuantifica una muestra desconocida contando la frecuencia de casos positivos en un gran número de informes de terminación en miniatura que se generan mediante la partición de la PCR cuantitativa a granel en miles o millones de nanolitros uniforme o reacciones picolitros 6. Se hace referencia como PCR gotita digital (es decir, en este artículo) o cámara de PCR digital, respectivamente, si las particiones son gotitas de agua-en-aceite (es decir, este artículo) o pequeñas cámaras en un chip. Una concentración de la muestra mayor resultará en presencia de ADN diana(PCR, por tanto, positiva) en una mayor proporción de particiones, una relación aproximada por distribución de Poisson. Como tal, los resultados binarios (PCR positivo o negativo) se registran y la frecuencia de las gotitas de positivos se utiliza para calcular las concentraciones de muestras desconocidas directamente a través de Poisson aproximación, eliminando la necesidad de una curva estándar como en qPCR.
Esta naturaleza binaria de la cuantificación de PCR digital proporciona ventajas adicionales sobre qPCR 7. Debido a que la amplificación retrasado todavía puede producir una PCR positiva, dPCR cuantificación es más robusto frente a la inhibición que reduce la eficiencia de amplificación. Del mismo modo, dPCR cuantificación no se ve afectada por la variabilidad en valores Cq como es qPCR, lo que aumenta la precisión de dPCR comparación con qPCR 8-10.
Además, el proceso de partición asegura una muy pequeña cantidad de ADN diana presente en cada gota, minimizando efectivamente la competencia sustrato (durante amplification de diferentes dianas de ADN) que son obstáculos comunes para lograr la impresión a doble cara (es decir, un ensayo mide simultáneamente dos dianas de ADN) en la qPCR. Como tal, si carrera en duplex o simplex (es decir, un objetivo se mide en un único ensayo) dPCR produce cuantificación casi indistinguibles de los dos objetivos de 7,11.
El objetivo del ensayo de PCR digital (EntHF183 dPCR) descrito en este artículo es obtener cuantificación directa simultánea del indicador fecal general de Enterococcus spp. Y el marcador HF183-humano fecal asociada con una mayor precisión, reproducibilidad y robustez frente a la inhibición en comparación con su qPCR homólogos. Este ensayo ha sido utilizado con éxito para la cuantificación de la contaminación fecal en agua dulce del medio ambiente, el agua marina, y diversos materiales fecal 7, pero también puede ser aplicado a cualquier otro tipo de aguas y aguas residuales. Este ensayo representa una gran promesa para el análisis de los sedimentos o suelos debido a sus alta tolerancia a la inhibición, pero se necesitan más pruebas debido a la complejidad de inhibidor se mezcla en este tipo de muestras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay unos pocos pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, la mezcla de las mezclas de ensayo puede ser difícil porque la mezcla maestra es más viscoso que las mezclas convencionales maestros qPCR. agitación simple puede conducir a una mezcla insuficiente, que a su vez conduce a una distribución no uniforme de moldes de ADN en las mezclas de ensayo y, posteriormente, en las gotitas. La técnica de mezcla por pipeteado se describe en el protocolo se debe seguir para asegurar la cuantificación precisa dPCR. En …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20uL pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200uL pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E.faecalius genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalius and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
Referenzen
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- Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
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