نحن هنا توظيف منهجية FISH لتتبع الخط 1 retrotransposition على مستوى نواة واحدة في هوامش كروموسوم من خطوط الخلايا HepG2 التعبير عن ثابت خط 1 الاصطناعية.
Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5′ truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.
الإنسان طويل تتخللها النووية العنصر 1 (الخط 1 أو L1) هو عنصر المنتقلة والمستقلة التي تنتشر داخل الجينوم من خلال "نسخ ولصق" آلية retrotransposition. وL1 الإنسان النموذجي هو ~ 6 كيلو بايت طويلة ويتكون من 5'UTR (منطقة غير مترجمة) التي هي بمثابة المروج، إطارين القراءة المفتوحة (ORFS): L1 -ORF1 وL1 -ORF2، و3'UTR مع بوليا . ذيل L1 البروتين -ORF1 ثلاثة مجالات مختلفة هي: مجال لفائف لفائف، RNA الاعتراف الحافز ونطاق C-محطة، بينما بروتين L1 -ORF2 ديه نوكلياز داخلية، عكس الناسخ والسيستين المجالات الغنية 1،2،3،4،5. L1 -ORF1 يسلك أنشطة حمض كوصي النووية، في حين يوفر L1 -ORF2 الأنشطة الإنزيمية، مع كل من البروتينات اللازمة لretrotransposition 1،2،6.
دورة من L1 retrotransposition يبدأ النسخ من 5'UTR من L1 </م> مرنا bicistronic التي كتبها RNA البلمرة الثاني، النبات إلى السيتوبلازم، والترجمة. في السيتوبلازم، L1 -ORF1 المعارض إما -binding رابطة الدول المستقلة حيث حزم RNA الخاص بها أو -binding العابرة حيث حزم الرنا الأخرى (أي، جيب / SVAS / الكاذبة) لتشكيل الجسيمات بروتين نووي ريبوزي (RNP) مع L1 -ORF2p 7، 8. RNPs نقل من داخل النواة حيث النشاط نوكلياز داخلية من النكات L1 -ORF2p الحمض النووي الجيني (gDNA) للكشف على OH – مجموعة 9، التي هي بدورها تستخدم من قبل الناسخ العكسي لرئيس الوزراء وعكس توليف الحمض النووي الريبي على الحمض النووي من نهاية 3 '. خلال التوليف العكسي، ورصدت في الشق الثاني من الحمض النووي 7-20 سنة مضت من موقع نيك الأصلي لإنشاء فواصل متداخلة التي تمتلئ لتشكيل توقيع تسلسل L1 الإدراج (على سبيل المثال، TTTTAA) دعا الازدواجية الموقع المستهدف (TSD) 9،10. وتعرف هذه العملية باسم هدفا رئيسيا عكس النسخ (TPRT) ويؤدي إلى insertiعلى النسخ الكاملة أو اقتطاع من L1 / السلطات الوطنية المعينة الأخرى مع TSDs على طرفي تسلسل المدرجة. كما ثبت L1 retrotransposition أن تتم من خلال TPRT مثل غير المتجانسة نهاية الانضمام في بعض الخلايا أنواع 11.
متجه L1 retrotransposition العاملين في دراستنا هو غير episomal ويتكون من الموسومة L1 -ORF1 و2P يقودها المروجين-CMV L1-5'UTR جنبا إلى جنب (الشكل 1) 12. وقد وصفت الإصدارات السابقة من هذا البناء في الدراسات التي تستخدم الخميرة والثقافات الخلية البشرية 13،14،15. اثنين من المروجين CMV متميز يقع في 5 'و 3' تنتهي من ناقلات، مع نهاية 3 'وضعت في اتجاه عكسي لدفع التعبير من النيوميسين بعد الربط والتكامل. الكاسيت مؤشر retrotransposition في نهاية 3 'يتكون من الجين إدراج العقاقير بالنيوميسين إلى L1 -ORFs وتقديم نشط من فصل إلى نصفين بواسطة غلوبفي إنترون مع الجهات المانحة تقسم (SD) ومواقع تقسم متقبل (SA) (الشكل 1). على الاندماج في كروموسوم، وكتب L1 من المروج مشترك لإنتاج الرنا المرسال الذي يتكون من مرنا bicistronic ومرنا بالنيوميسين غير نشط. أثناء معالجة RNA، وتقسم على إنترون الغلوبين من الجين بالنيوميسين لاستعادة جين بالنيوميسين تعمل بكامل طاقتها. يتم حزم مرنا الهجين في الأداء الملاحي المطلوب في رابطة الدول المستقلة وtranslocated الى نواة حيث يتم دمجها في الجينوم إما كامل طول أو اقتطاع الإدراج باستخدام TPRT.
نحن هنا وصف المنهجية التي تستخدم مضان في الموقع التهجين (FISH) مع تحقيقات موجهة تحديدا في الجين بالنيوميسين تقسم (SNeo) لتتبع أنماط -retrotransposiition L1 ومعدلات الإدراج في مستوى نواة واحدة. وأكد كفاءة وخصوصية كشف باستخدام retrotransposition المختصة وبنيات غير كفء وتحقيقات لديتإلخ SNeo أو النيومايسين وغلوبين إنترون تقاطع 16. حسابات هذه المنهجية لبعض من أوجه القصور في المقايسات retrotransposition ثقافة خلية مقرها، مثل الإدراج متعددة، ومقاومة مستعمرة والتوسع استنساخ مواتية.
وقد تم توظيف منهجيات مثل تسلسل الجينوم بأكمله، معكوس PCR والنشاف جنوب لدراسة L1 retrotransposition. على الرغم من أن هذه المنهجيات هي قيمة للغاية في تحديد مكان وقوع الإدراج L1 داخل الجينوم، تحديا الخلط لجميع من لهم هو الحاجة إلى برمجة في سيليكون لإعادة تجميع متوالي?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by grants from the National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 and ES017274) and AstraZeneca to KSR.
Labeling Probes | |||
Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
GO Tag 10X colorless buffer | Promega | M3178 | |
Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2mM and dTTP to 1.5mM in nuclease free water. |
dUTP-16-Biotin (0.5mM) | Roche | 11093070910 | |
dUTP-FITC (0.5mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
dUTP-CY3 (0.5mM) | Sigma | GEPA53022 | |
MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
Agarose | Sigma | A9539 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Preparing chromosome Spreads. | |||
Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/mL |
1M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
Methanol | Sigma | 322415 | |
Acetic acid | Sigma | 320099 | |
Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL. |
Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 mins and inactive with equal volume of complete media |
Cover slides | VWR | 48366067 | |
Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
Beaker (600ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents and Materials for FISH | |||
Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
Formamide | Sigma | F9037 | |
Tween-20 | Sigma | F1379 | |
Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
SDS | Sigma | L3771 | |
Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
HCl (N) | Sigma | 38283 | |
Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
Rnase A | Sigma | R4642 | |
Pepsin | Sigma | P6887 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL. |
Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
Cover slides | VWR | 48366067 | |
Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
Fluorescence Microscope | |||
20X Saline-Sodium Citrate (20X SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 mL of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
1mg/mL of Rnase A | Dilute 20X SSC buffer to 2X SSC buffer. Dissolve RNase A in 2X SSC buffer to a final concentration of 1 mg/mL. Make fresh solution every time. | ||
1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1 % solution. Make fresh every time. | ||
4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 mL of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 mL, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 mL aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
Wash Buffer | Combine 100 mL of Formamide (20%) with 2.5 mL of 20X SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 mL with molecular grade H2O. | ||
Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/mL Salmon Sperm DNA in 2X SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are, titrate the amount | ||
Detection Buffer | Dilute 20X SSC buffer to 4X and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4X SSC buffer. | ||
Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. |