Здесь мы используем методологию FISH для отслеживания LINE-1 ретротранспозиции на одном уровне ядер в хромосомных спредов клеточных линий HepG2 , стабильно экспрессирующих синтетический LINE-1.
Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5′ truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.
Человек Длинные перемежаются Ядерный элемент-1 (линия-1 или L1) представляет собой автономный подвижный элемент , который распространяется внутри генома через "копировать и вставить" механизм ретротранспозиции. Типичный человек L1 имеет длину ~ 6 кб и состоит из 5'UTR (Непереведенные область) , который служит в качестве промотора, две открытые рамки считывания (ORFs): L1 -ORF1 и L1 -ORF2 и 3'UTR с полиА . хвост L1 -ORF1 белок имеет три различных областях: доменное катушки катушки, РНК и распознавания Motif С-концевой домен, в то время как L1 -ORF2 белок имеет эндонуклеазы, обратной транскриптазы и цистеина богатые домены 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 проявляет деятельность нуклеиновой кислоты Chaperone, в то время как L1 -ORF2 обеспечивает ферментативную активность, с обоих белков , необходимых для ретротранспозиции 1,2,6.
Цикл L1 ретротранспозиции начинается с транскрипции от 5' – UTR L1 , </EM> бицистронный мРНК с помощью РНК-полимеразы II, транслокации в цитоплазму, и перевод. В цитоплазме L1 -ORF1 проявляет либо цис -связывающим , где пакеты свою собственную РНК или транс -связывающим , где пакеты других РНК (т.е., синусоида / СВА / Псевдогены) с образованием рибонуклеопротеиновый частицы (RNP) с L1 -ORF2p 7, 8. Рибонуклеопротеиды транслокации в ядро , где эндонуклеаза активность L1 -ORF2p зарубок геномную ДНК (GDNA) , чтобы разоблачить ОН – группа 9, что в свою очередь , используется обратной транскриптазы для простого и обратного синтезировать РНК в ДНК с 3' – конца. Во время обратного синтеза, вторая цепь ДНК порезал 7-20 пар оснований от исходного сайта нику , чтобы создать в шахматном порядке перерывы , которые заполнены для формирования подписи вставки L1 последовательности (например, TTTTAA) называется дупликации целевой сайт (ТСД) 9,10. Этот процесс известен как целевой Prime обратной транскрипцией (TPRT) и приводит к insertiна полных или усеченных копий L1 / других ДНК с TSDs на обоих концах вставленной последовательности. L1 ретротранспозиции также было показано, опосредовано через TPRT типа негомологичный конечного присоединения в некоторых типах клеток 11.
Вектор L1 ретротранспозиции используется в наших исследованиях является неэписомные и состоит из маркированного L1 -ORF1 & 2р движимый комбинированных ЦМВ-L1-5'UTR промоутеров (рис 1) 12. Более ранние версии этой конструкции были описаны в исследованиях с использованием дрожжей и клеточных культур человека 13,14,15. Два различных CMV промоторы, расположенные на 5 'и 3'-концы вектора, с 3'-конец помещен в обратной ориентации по отношению к управлению экспрессией неомицина после сращивания и интеграции. Кассета индикатор ретротранспозиции на 3' – конце состоит из ген неомицина вставляется антисмысловой по отношению к L1 -ORFs и приведены в нерабочее состояние путем разделения на две половины Глобв интроне с сращивания донора (SD) и сращены акцептор (SA) участки (рисунок 1). После интеграции в хромосому, L1 , транскрибируется из общего промотора для получения мРНК , которая состоит из бицистронной мРНК , так и неактивный неомицина мРНК. Во время обработки РНК, глобина интрон сращены из гена неомицин, чтобы восстановить полностью функциональный ген неомицина. Гибридный мРНК упаковывается в РНП в цис и транслокации в ядро , где он встроен в геном либо как полной длины или усеченных вставок с использованием TPRT.
Здесь мы опишем методологию , которая использует флуоресценции в гибридизация (FISH) с зондами , специально направленных на сращивания геном неомицин (SNeo) , чтобы отслеживать L1 -retrotransposiition модели и скорости вставки на одном уровне ядра. Эффективность и специфичность обнаружения была подтверждена с использованием ретротранспозиции компетентных и некомпетентных конструкции и зонды опрЭСТ SNeo или неомицин и глобина интрона 16. Эта методология учитывает некоторые из недостатков ретротранспозиции анализов на основе клеточных культур, таких как множественные вставки, сопротивление колонии и благоприятного расширения клона.
Методологии , такие как целого генома, обратной ПЦР и Саузерн – блоттинга были использованы для изучения L1 ретротранспозиции. Хотя эти методики являются чрезвычайно ценными в поиске , где L1 вставки происходят в геномах, Поразительным вызов для всех из них является необходимос?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by grants from the National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 and ES017274) and AstraZeneca to KSR.
Labeling Probes | |||
Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
GO Tag 10X colorless buffer | Promega | M3178 | |
Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2mM and dTTP to 1.5mM in nuclease free water. |
dUTP-16-Biotin (0.5mM) | Roche | 11093070910 | |
dUTP-FITC (0.5mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
dUTP-CY3 (0.5mM) | Sigma | GEPA53022 | |
MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
Agarose | Sigma | A9539 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Preparing chromosome Spreads. | |||
Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/mL |
1M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
Methanol | Sigma | 322415 | |
Acetic acid | Sigma | 320099 | |
Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL. |
Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 mins and inactive with equal volume of complete media |
Cover slides | VWR | 48366067 | |
Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
Beaker (600ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents and Materials for FISH | |||
Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
Formamide | Sigma | F9037 | |
Tween-20 | Sigma | F1379 | |
Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
SDS | Sigma | L3771 | |
Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
HCl (N) | Sigma | 38283 | |
Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
Rnase A | Sigma | R4642 | |
Pepsin | Sigma | P6887 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL. |
Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
Cover slides | VWR | 48366067 | |
Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
Fluorescence Microscope | |||
20X Saline-Sodium Citrate (20X SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 mL of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
1mg/mL of Rnase A | Dilute 20X SSC buffer to 2X SSC buffer. Dissolve RNase A in 2X SSC buffer to a final concentration of 1 mg/mL. Make fresh solution every time. | ||
1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1 % solution. Make fresh every time. | ||
4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 mL of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 mL, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 mL aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
Wash Buffer | Combine 100 mL of Formamide (20%) with 2.5 mL of 20X SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 mL with molecular grade H2O. | ||
Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/mL Salmon Sperm DNA in 2X SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are, titrate the amount | ||
Detection Buffer | Dilute 20X SSC buffer to 4X and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4X SSC buffer. | ||
Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. |