Burada stabil sentetik LINE-1 ifade eden HepG2 hücre hatlarının kromozom yayılır tek çekirdek düzeyinde HAT-1 retrotransposition izlemek için FISH metodolojisini kullanır.
Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5′ truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.
İnsan Uzun Interspersed Nükleer Element-1 (Hat-1 veya L1) retrotransposition mekanizmasını bir geçiş genomu içinde yayılır "kopya ve yapıştır" özerk mobil unsurdur. Tipik bir insan L1 ~ 6 kb uzunluğundadır ve bir promoter olarak hizmet veren bir 5'UTR (çevrilmemiş bölgesinin) oluşur, iki açık okuma çerçevesi (ORF): L1 -ORF1 L1 -ORF2 ve polyA bir 3'UTR . bobin bobin alanı, bir RNA tanıma motif ve C-terminal sahası, L1 -ORF2 proteini endonükleaz sahipken, transkriptaz ve sistin zengin alanları 1,2,3,4,5 tersine: yükleme L1 -ORF1 proteini üç farklı etki vardır. L1 -ORF2 retrotransposition 1,2,6 için gerekli iki proteinler ile, enzimatik aktiviteleri sağladığına; L1 -ORF1, nükleik asit şaperon aktivitelerini sergiler.
L1 retrotransposition bir döngü L1 5'UTR transkripsiyon ile başlar </em> RNA polimeraz II, translokasyon sitoplazmaya ve çeviri tarafından bicistronic mRNA. Sitoplazma L1 -ORF1 sergiler, ya diğer RNA paketleri kendi RNA paketleri sis bağlayıcı eksojen veya trans bağlayıcı eksojen (örneğin, sinüs / SVAS / sözde genlerin) L1 -ORF2p 7 olan bir ribonükleoprotein parçacık (RNP) oluşturmak için, 8. Bu ana ters transkriptaz tarafından kullanılan da gruptur, 9 ve 3 'ucundan DNA sentez RNA ters – RNP L1 -ORF2p çentik genomik DNA (gDNA) arasında endonükleaz aktivitesi, OH ortaya çıkarmak için çekirdek içine. Ters sentezi sırasında, DNA'nın ikinci şerit imzası L1 ekleme dizileri (örneğin, TTTTAA) olarak adlandırılan hedef site duplikasyonları (TSD) 9,10 oluşturmak için doldurulur sendeleyerek kesmeleri oluşturmak için orijinal nick sitesinden 7-20 bp nicked edilir. Bu işlem, hedef ana ters transkripsiyon (TPRT) olarak bilinir ve inserti neden olduğueklenen dizinin her iki ucunda TSDs L1 / diğer DNA'lar tam ya da tepe bölümü kesik kopya ile. L1 retrotransposition aracılığıyla da aracılık ettiği gösterilmiştir homolog olmayan uç birleştirme bazı hücre tiplerinde 11 TPRT benzeri.
Çalışmalarımızda kullanılan L1 retrotransposition vektör epizomal olmayan ve etiketli L1 -ORF1 ve 2p Birleştirilen CMV L1-5'UTR promoterler tarafından tahrik (şekil 1) 12 oluşur. Bu yapının önceki versiyonları maya ve insan hücre kültürleri 13,14,15 kullanıldığı çalışmalarda tarif edilmiştir. 3 'ucu yapıştırma ve entegrasyon sonrasında neomisin ekspresyonunu tahrik etmek için ters yönde yerleştirilmiş olan 5' ve 3 'yer alan iki ayrı CMV promoterler, vektörün sona erer. 3 'ucunda retrotransposition göstergesi kaseti L1 -ORFs bir neomisin geni yerleştirilmiş antisens oluşur ve topak iki parçaya ayrılması ile aktif olmayan haleeklenmiş verici (SD) ve eklenmiş alıcı (SA) siteleri (Şekil 1) introna, uygun olarak. Bir kromozom içine entegrasyon üzerine, L1 bir bicistronic mRNA ve inaktif neomisin mRNA oluşan bir mRNA üretmek için ortak promotör transkripsiyonu. RNA işlenmesi sırasında, globin intron tamamen işlevsel bir neomisin geni geri neomisin genin dışında birleştirilir. Hibrid mRNA cis bir RNP içine paketlenmiş ve TPRT kullanılarak tam uzunluklu ya da kesilmiş ya da sokulmasını genomuna entegre edilir çekirdeğe transloke edilmiştir.
Burada tek çekirdek düzeyinde L1 -retrotransposiition desen ve yerleştirme oranlarını izlemek için özel olarak eklenmiş neomisin geni (sneo) yönelik problar ile in situ hibridizasyon (FISH) floresan kullanan bir metodoloji tarif eder. verimlilik ve algılama özgüllüğü det yetkili retrotransposition ve beceriksiz yapıları ve problar kullanılarak teyit edildiEKT sneo veya intron kavşağı 16 globin neomisin ve. Bu metodoloji, çoklu eklemeler, koloni direnci ve olumlu klon genişleme olarak hücre kültürü temelli retrotransposition deneyleri, eksikliklerin bazıları oluşturmaktadır.
Böyle tüm genom dizileme, ters PCR ve güney blot olarak metodolojileri L1 retrotransposition incelemek için istihdam edilmiştir. Bu metodolojiler L1 eklemeleri genomları içinde meydana nerede yerini son derece değerli olmasına rağmen, hepsi için bir karıştırıcı zorluk dizileri yeniden birleştirmek için-siliko programlama için ihtiyaçtır. Burada açıklanan BALIK yöntemi, özellikle kültür hücrelerinde ektopik L1 retrotransposition analizleri gerektiren çalı?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by grants from the National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 and ES017274) and AstraZeneca to KSR.
Labeling Probes | |||
Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
GO Tag 10X colorless buffer | Promega | M3178 | |
Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2mM and dTTP to 1.5mM in nuclease free water. |
dUTP-16-Biotin (0.5mM) | Roche | 11093070910 | |
dUTP-FITC (0.5mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
dUTP-CY3 (0.5mM) | Sigma | GEPA53022 | |
MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
Agarose | Sigma | A9539 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Preparing chromosome Spreads. | |||
Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/mL |
1M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
Methanol | Sigma | 322415 | |
Acetic acid | Sigma | 320099 | |
Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL. |
Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 mins and inactive with equal volume of complete media |
Cover slides | VWR | 48366067 | |
Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
Beaker (600ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents and Materials for FISH | |||
Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
Formamide | Sigma | F9037 | |
Tween-20 | Sigma | F1379 | |
Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
SDS | Sigma | L3771 | |
Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
HCl (N) | Sigma | 38283 | |
Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
Rnase A | Sigma | R4642 | |
Pepsin | Sigma | P6887 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL. |
Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
Cover slides | VWR | 48366067 | |
Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
Fluorescence Microscope | |||
20X Saline-Sodium Citrate (20X SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 mL of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
1mg/mL of Rnase A | Dilute 20X SSC buffer to 2X SSC buffer. Dissolve RNase A in 2X SSC buffer to a final concentration of 1 mg/mL. Make fresh solution every time. | ||
1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1 % solution. Make fresh every time. | ||
4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 mL of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 mL, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 mL aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
Wash Buffer | Combine 100 mL of Formamide (20%) with 2.5 mL of 20X SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 mL with molecular grade H2O. | ||
Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/mL Salmon Sperm DNA in 2X SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are, titrate the amount | ||
Detection Buffer | Dilute 20X SSC buffer to 4X and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4X SSC buffer. | ||
Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. |