Rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules T Receptor Retrogenic Souris
Summary
We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
Abstract
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
Introduction
Récepteur des cellules T (TCR) de répertoire humain et la souris a été estimée à 1 x 10 8 et 2 x 10 6 RLT uniques respectivement 1,2. Cette grande diversité permet aux cellules T de reconnaître une vaste gamme d'épitopes d'antigènes dérivés d'auto-peptides, ainsi que des agents pathogènes présentés par le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) sur les cellules présentatrices d'antigènes (APC). Les différences subtiles dans les interactions des RLT uniques avec des complexes peptide-CMH déterminent si une cellule T subira l'apoptose, l'anergie, l'activation, la différenciation, la production de cytokine ou la cytotoxicité. Toutefois, en raison du grand répertoire de TCR, l'analyse de la façon dont un TCR spécifique de répondre à un antigène particulier nécessite l'utilisation de systèmes de TCR unique.
Diverses souris transgéniques TCR ont été générés dans le but d'étudier la fonction d'un seul TCR dans un modèle in vivo 3-9. Cependant, il existe des réserves de TCR des souris transgéniques, y compris lale coût, la durée de temps pour générer une seule souris transgénique et le soi – disant effet fondateur d'insertion du transgène aléatoire dans l' ADN de la lignée germinale 10. Par conséquent, relativement peu de souris transgéniques TCR ont été générées pour tout antigène donné et les implications fonctionnelles de haute affinité et une faible TCR pour le même épitope sont rarement pris en compte. Pour répondre à la nécessité d'une approche rapide à l' écran et d' étudier plusieurs TCR individuellement ou en combinaison, les souris retrogenic ( «rétro» de retrovirus et 'géniques' de transgéniques) ont été utilisés comme une alternative à TCR des souris transgéniques 11-13.
Le motif consensus 2A peptide trouvés dans plusieurs virus sont constitués par un 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, dans laquelle le clivage se produit entre la glycine, de la figure 2A et la proline de la figure 2B de l'activité hydrolase de cis, ce qui entraîne le saut du ribosome pendant la traduction 10,14-16. Pour un diagramme détaillé représentant la cleavage des différents peptides 2A (F2A, E2A, T2A et P2A) s'il vous plaît se référer aux références 10 – 12. De cette manière, 2 cistrons (TCR alpha et TCR bêta) peuvent être liés résultant en traduction stoechiométrique dans un seul vecteur. En utilisant cette approche, nous sommes en mesure d'exprimer et de comparer directement plusieurs TCR spécifiques de l' antigène in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le protocole, nous détaillons plusieurs étapes essentielles pour assurer la santé de la moelle osseuse optimale, l'efficacité de la transduction et la reconstitution. Première étape critique est la génération et le bon entretien des cellules productrices virale GP + E86. Utiliser des lignées de cellules productrices de passages précoces et maintenir à 80% de confluence ou plus bas avant l'utilisation. Lors de cellules productrices virale GP + E86 frais, assurer que les cellules 293T sont passage …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (5K22A1119151-01 et 1R56DK104903-01) à MLB, Programme du Centre de recherche du diabète (P30-de DK079638) au BCM Pilot / faisabilité, la FRDJ 1-FAC-2014-243-AN CSA, ADA 1-15-JF-07, AAI Carrières in Immunology Fellowship à MB, et Le Robert et la Fondation Janice McNair.
Materials
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
Referenzen
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