골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는
Summary
We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
Abstract
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
Introduction
인간 및 마우스의 T 세포 수용체 (TCR) 레파토리는 1 × 108, 2 × 106 고유 TCR도 각각 1.2로 추정되었다. 이 넓은 다양성은 T 세포는자가 펩티드에서뿐만 아니라 항원 제시 세포 (APC를)의 주 조직 적합성 복합체 (MHC)에 의해 제공 병원체 유래의 항원 에피토프의 광대 한 배열을 인식 할 수있다. 독특한 펩타이드 MHC 단지와 TCR도의 상호 작용의 미묘한 차이는 T 세포가 사멸, 아네 르기, 활성화, 분화, 사이토 카인 생산 세포 독성을 받아야할지 여부를 지시. 그러나, 큰 TCR 레퍼토리 특정 TCR 특정 항원에 응답하는 방법의 분석은 하나의 TCR 시스템의 사용을 필요로한다.
다양한 TCR 유전자 변형 마우스를 생체 내 모델 3-9 단일 TCR의 기능을 연구하기 위해 생성되었다. 그러나, 포함하는 형질 전환 마우스를 TCR 할주의 사항이있다선정 된 하나의 트랜스 제닉 마우스 생식선 DNA (10)에 임의의 형질 전환 유전자 삽입 소위 창시자 효과를 생성하는 시간의 길이. 따라서, 비교적 적은 TCR 형질 전환 마우스는 임의의 주어진 항원에 대해 생성 된 동일한 에피토프에 대한 고 및 저 TCR 친화력의 기능적 의미는 거의 언급하지 않는다. 화면 빠른 접근을위한 필요성을 해결 개별적으로 또는 조합하여 복수의 TCR도 공부 (레트로 바이러스 '레트로'형질 전환에서 '제닉') retrogenic 마우스는 형질 전환 마우스 11-13 TCR의 대안으로 이용되어왔다.
여러 바이러스에서 발견 된 2A 펩타이드 합의 모티브 분열은 2A의 글리신과 2B의 프롤린 사이에 발생하는에서, 2A-ASP를-발 / 일드 – 공급 과잉-X-ASN-프로의 Gly-2B-프로 구성 시스 -acting 가수 분해 효소 활동에서 번역 10,14-16 동안 리보솜 건너 뛰기 결과. 은 C를 나타내는 상세한 다이어그램이러한 방식으로, 하나의 벡터 화학 양론 번역의 결과로 연결될 수 2 시스 트론 (TCR 알파와 TCR 베타) (12) -를 다양한 2A 펩티드 (F2A, E2A, T2A 및 P2A)의 leavage 참고 문헌 10를 참조하십시오. 이 방법을 활용하여, 우리는 표현하고 직접 생체 내에서 여러 항원 특정 TCR도 비교 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜에서, 최적의 골수 건강, 전달 효율 및 재구성을 보장하기 위해 여러 세부 중요한 단계를 우리. 첫 번째 중요한 단계는 생성 및 GP + E86 바이러스 생산자 세포의 적절한 유지된다. 초기 통로 생산 세포주를 사용하여 80 % 컨 플루 이하 사용하기 전에에서 유지한다. 48 시간 – 신선한 GP + E86 바이러스 생산 세포를 만드는 경우, 293T 세포가 초기 통로 (24)에 대한 문화에서 성장되어 있는지 확인합?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 MLB, BCM에서 당뇨병 연구 센터 (P30-DK079638)의 파일럿 / 타당성 프로그램, JDRF 1-FAC-2014-243-APF, ADA에 NIH (5K22A1119151-01 및 1R56DK104903-01)에서 보조금에 의해 지원되었다 1-15-JF-07, 면역학 MB에 친목, 그리고 로버트와 제니스 맥 네어 재단 AAI 채용.
Materials
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
Referenzen
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein ‘cleavage’ mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal ‘skip’. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for “StopGo”: reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
