Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) en genexpressie analyse van Fos expressie neuronen van verse en diepgevroren Rat Brain Tissue
Summary
Hier presenteren we een Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol om moleculaire veranderingen studeren in Fos-uiting van neuronale ensembles van zowel verse als bevroren hersenweefsel. Het gebruik van bevroren weefsel maakt FACS isoleren van vele hersengebieden over meerdere zittingen aan het gebruik van kostbare proefdieren maximaliseren.
Abstract
De studie van neuroplasticiteit en moleculaire veranderingen in aangeleerd gedrag schakelt uit de studie van hele hersenen van de studie van specifieke sets van dun verspreid geactiveerde neuronen genaamd neuronale ensembles bemiddelen geleerd associaties. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is onlangs geoptimaliseerd voor volwassen rat hersenweefsel en liet isolatie van geactiveerde neuronen met behulp van antilichamen tegen neuronale merker NeuN en Fos eiwit, een marker van sterk geactiveerd neuronen. Tot nu toe werden Fos expressie brengende neuronen en andere celtypen geïsoleerd uit vers weefsel, dat lange verwerking dagen en men liet zeer beperkt aantal hersenmonsters worden bepaald na langdurige en complexe gedragsprocedures meebrengt. Hier vonden we dat de rendementen van Fos expressie neuronen en Fos mRNA uit dorsale striatum waren vergelijkbaar tussen vers ontleed weefsel en weefsel bevroren bij -80 ° C gedurende 3-21 dagen. Daarnaast bevestigde we het fenotypevan de Neun-positieve en NeuN-negatieve gesorteerde cellen door het bepalen van genexpressie van neuronale (NeuN), astrocyten (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) en microgial (Iba1) markers, wat aangeeft dat ingevroren weefsel kan ook worden gebruikt voor FACS isoleren gliale celsoorten. Kortom, het is mogelijk te verzamelen, ontleden en vries hersenweefsel voor meerdere FACS sessies. Dit maximaliseert de hoeveelheid gegevens verkregen van waardevolle dierlijke patiënten die vaak ondergaan lange en ingewikkelde gedragsprocedures.
Introduction
Tijdens het leren, dieren vormen associaties tussen complexe sets van zeer specifieke stimuli. Deze hoge-resolutie-informatie wordt gedacht te worden gecodeerd door wijzigingen binnen specifieke patronen van dun verspreid neuronen genaamd neuronale ensembles. Neuronale ensembles zijn onlangs geïdentificeerd door de inductie van onmiddellijk vroege genen (IEG 's), zoals Fos, Arc en Zif268 en hun eiwitproducten in neuronen die sterk in gedrag of cue exposure werden geactiveerd. Fos-expressie neuronen in het bijzonder is aangetoond dat oorzakelijke rol in context en cue-specifieke aangeleerd gedrag 1-4. Aldus unieke moleculaire neuroadaptations binnen deze geactiveerde Fos expressie brengende neuronen top kandidaten voor de neurale mechanismen die coderen geleerd verenigingen gevormd tijdens normale en abnormale leren leerstoornissen, zoals verslaving en posttraumatische stressstoornis (PTSS) 5.
fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) heeft onlangs toegestaan analyse van unieke moleculaire neuroadaptations in Fos expressie neuronen. Flowcytometrie en celsortering werden ontwikkeld in 1960 6,7 cellen te karakteriseren en te isoleren op basis van hun lichtverstrooiing eigenschappen en immunofluorescentie en zijn lang gebruikt in immunologie en kankeronderzoek. Echter flowcytometrie en FACS vereist gedissocieerde losse cellen die moeilijk te verkrijgen uit volwassen hersenweefsel zijn. FACS werd eerst gebruikt voor het isoleren en analyseren van Green Fluorescent Protein (GFP) tot expressie brengen striatale neuronen van transgene muizen die geen antilichaam labeling 8,9 vergde. We ontwikkelden een antilichaam gebaseerde FACS werkwijze 10 voor het isoleren en moleculaire veranderingen beoordelen Fos expressie brengende neuronen geactiveerd door drugs en / of aanwijzingen in wildtype dieren 11-15. In deze werkwijze worden neuronen gelabeld met een antilichaam tegen het algemene neurale marker NeuN, terwijl sterk geactiveerd neuronenzijn gemerkt met een antilichaam tegen Fos. Hoewel onze eerste werkwijze vereist bundeling tot 10 ratten per monster voor vers weefsel, verdere wijziging van protocol toegestane FACS isolatie van Fos-expressie (qPCR) analyse van discrete hersengebieden neuronen en kwantitatieve polymerasekettingreactie vanaf één rat 13-15 . In totaal werden unieke moleculaire veranderingen gevonden in Fos expressie neuronen geactiveerd tijdens een verscheidenheid aan context- en cue geactiveerd gedrag in de verslavingszorg onderzoek 12,14,15.
Een groot logistiek probleem bij het uitvoeren van FACS op verse weefsel is dat het een hele dag aan het weefsel en proces FACS dissociëren. Bovendien kan slechts vier monsters per dag worden verwerkt. Dit betekent gewoonlijk dat slechts een hersengebied van elke hersenen mogelijk is en de resterende hersengebieden moeten worden weggegooid. Dit is een groot probleem voor de lage throughput gedrags-procedures, zoals self-administratie en uitsterven training dat een operatie en vele weken van intensieve training vereist. Verder lang en ingewikkeld gedragsprocedures op testdag bemoeilijkt FACS voeren op dezelfde dag. Het zou een aanzienlijk voordeel kunnen de hersenen bevriezen van de dieren direct na gedragstesten en daarna uit een of meer hersengebieden isoleren Fos expressie neuronen op verschillende tijdstippen van de keuze onderzoekers.
Hier laten we zien dat onze FACS protocol kan worden gebruikt voor Fos expressie neuronen (en andere celtypen) van verse of bevroren hersenweefsel isoleren. Als voorbeeld, geïsoleerde we Fos expressie neuronen van de rat striatum na een acuut methamphetamine injecties en van naïeve ratten zonder injecties (controle conditie). Dit kan echter FACS protocol worden gebruikt na elke gedragstherapie of farmacologische behandeling. Daaropvolgende qPCR analyse van onze monsters aangegeven dat de genexpressie van deze celtypen kon worden beoordeeld met SimiLAR efficiency van zowel verse als bevroren weefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS kan worden gebruikt om neuronen en andere celtypen uit verse of ingevroren volwassen hersenweefsel sorteren. Zoals vermeld in de inleiding, de mogelijkheid om bevroren weefsel te gebruiken maakt optimaal gebruik van monsters van dieren die complexe en langdurige gedrags- procedures, zoals zelf-administratie en terugval studies in de verslavingszorg onderzoek hebben ondergaan. Deze gedrags-procedures duurt meestal 1-2 uur of langer, en vereisen dat alle dieren (10 – 20 in totaal) worden getest op dezelfde dag 1…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. was supported by an appointment to the NIDA Research Participation Program sponsored by the National Institutes of Health and administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education, and received additional financial support from a Becas-Chile scholarship managed by CONICYT and the Universidad de los Andes, Santiago, Chile. The Johns Hopkins FACS Core facility was supported by Award P30AR053503 from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health.
Materials
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A' in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution' in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
Referenzen
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
- Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
- Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
- Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. Spectrophotometric cell sorter. Science. 156, 1364-1365 (1967).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
- Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
- Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
- US National Research Council. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
- Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
- Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
- Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).
