Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) и экспрессии генов Анализ Fos-экспрессирующих Нейроны из свежих и замороженных крыс ткани головного мозга
Summary
Здесь мы приводим протокол Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) для изучения молекулярных изменений в Фос-экспрессирующих нейронные ансамбли из свежих и замороженных тканей мозга. Использование замороженной ткани позволяет FACS изоляцию многих областей мозга более нескольких сеансов, чтобы максимально использовать ценные предметы животного происхождения.
Abstract
Изучение нейропластики и молекулярных изменений в изученных поведения переходит из исследования целых регионов мозга к изучению конкретных наборов единично активированных нейронов, называемых нейронных ансамблей, которые опосредуют ученые ассоциации. Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) недавно была оптимизирована для ткани взрослого мозга крысы и позволил выделение активированных нейронов с использованием антител против нейронального маркера NeuN и белка Fos, маркер сильно активированных нейронов. До сих пор, Фос-экспрессирующие нейроны и другие типы клеток были выделены из свежей ткани, что повлекло за собой долгие дни обработки и позволили очень ограниченное количество образцов мозга, которые будут оценены после длительных и сложных поведенческих процедур. Здесь мы обнаружили , что выходы Fos-экспрессирующих нейронов и мРНК Fos из спинного стриатума были похожи между свеже рассеченной ткани и ткани замораживали при -80 ° С в течение 3 – 21 дней. Кроме того, мы подтвердили фенотипиз NeuN-положительных , так и к NeuN-отрицательных отсортированных клеток путем оценки экспрессии гена нейрональной (NeuN), астроцитов (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) и microgial (Iba1) маркеров, что свидетельствует о том , что замороженные ткани также могут быть использованы для FACS изоляции глиальные типов клеток. В целом, можно собирать, анализировать и замораживать ткани мозга для нескольких сеансов FACS. Это увеличивает объем данных, полученных от ценных предметов животного происхождения, которые часто подверглись длинные и сложные поведенческие процедуры.
Introduction
Во время обучения, животные образуют ассоциации между комплексными наборами весьма специфических стимулов. Эта информация с высокой разрешающей способностью, как полагают, кодируемый изменениями в конкретных моделей единично нейронов, называемых нейронными ансамблями. Нейронные ансамбли недавно были идентифицированы с помощью индукции немедленно ранних генов (IEGs) , таких как Fos, дуга, и Zif268 и их белковых продуктов в нейронах , которые были сильно активируются во время поведения или воздействия метки. Fos-экспрессирующих нейронов , в частности , было показано, играют роль в причинно – следственные связи и кием по конкретным извлеченные модели поведения 1-4. Таким образом, уникальные молекулярные neuroadaptations в этих активированных Fos-экспрессирующих нейронов являются главными кандидатами для нейронных механизмов , которые кодируют узнали ассоциации , сформированные в процессе обучения и нормальных ненормальным обучения расстройств, таких как наркомания и посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) 5.
FluoreScence Активированный сортировки клеток (FACS) недавно позволил анализ уникальных молекулярных neuroadaptations в пределах Fos-экспрессирующих нейронов. Проточная цитометрия и сортировка клеток были разработаны в 1960 – е годы 6,7 охарактеризовать и выделения клеток в соответствии с их светорассеивающих и иммунофлуоресцентных характеристиками, и уже давно используются в области иммунологии и исследования рака. Однако проточной цитометрии и FACS требует диссоциированных отдельных клеток, которые трудно получить из ткани мозга взрослого. FACS впервые был использован для выделения и анализа зеленого флуоресцентного белка (GFP) -expressing нейронов стриатума от трансгенных мышей , которые не требуют маркировки антител 8,9. Мы разработали антитела на основе метода FACS 10 для выделения и оценки молекулярных изменений в Фос-экспрессирующих нейронов , активированные лекарственного средства и / или репликами у диких животных типа 11-15. В этом методе, нейроны помечены антителом против общего нейронального маркера NeuN, в то время как сильно активируются нейронымаркированы с антителом против FOS. Хотя наш первоначальный метод требовал объединения до 10 крыс на образец для свежей ткани, последующие модификации протокола позволил FACS изоляцию Фос-выражающей нейронов и количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) анализа дискретных областей мозга от одной крысы 13-15 , В целом, уникальные молекулярные изменения были найдены в Фос-экспрессирующие нейроны активируются во время различных контекстно- и биток активированные поведения в наркомании исследований 12,14,15.
Одна из основных проблем с материально-технического выполнения FACS на свежей ткани является то, что она занимает целый день, чтобы отделить ткани и процесс путем FACS. Кроме того, лишь около четырех образцов могут быть обработаны в день. Как правило, это означает, что только одна область мозга может быть оценена из каждого мозга, а остальные участки мозга должны быть отброшены. Это является серьезной проблемой для низкой пропускной способности поведенческих процедур, таких как самостоятельного введения и исчезновения Traiнин, что требует хирургического вмешательства и много недель интенсивных тренировок. Кроме того, длинные и сложные поведенческие процедуры на день тестирования затрудняет выполнение FACS в тот же день. Было бы существенным преимуществом, чтобы иметь возможность заморозить мозг у животных сразу же после тестирования поведения, а затем изолировать Фос-экспрессирующие нейроны от одной или нескольких областях головного мозга в разное время по своему выбору следователей.
Здесь показано, что наш протокол FACS могут быть использованы для выделения Фос-экспрессирующие нейроны (и другие типы клеток) из свежих и замороженных тканей мозга. В качестве примера, мы выделили Fos-экспрессирующих нейронов крысы из стриатума после острого метамфетамина инъекций и от наивных крыс без инъекций (контрольной группы). Тем не менее, этот протокол FACS может быть использован после любого поведенческого или фармакологического лечения. Дальнейший анализ КПЦР наших образцов показали, что экспрессия гена из этих типов клеток могут быть оценены с СимиЭффективность лар из свежих и замороженных тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS могут быть использованы для сортировки нейроны и другие типы клеток из свежей или замороженной ткани мозга взрослого человека. Как уже упоминалось во введении, возможность использования замороженной ткани позволяет оптимальное использование образцов от животных, которые подверг?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. was supported by an appointment to the NIDA Research Participation Program sponsored by the National Institutes of Health and administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education, and received additional financial support from a Becas-Chile scholarship managed by CONICYT and the Universidad de los Andes, Santiago, Chile. The Johns Hopkins FACS Core facility was supported by Award P30AR053503 from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health.
Materials
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A' in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution' in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
Referenzen
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
- Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
- Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
- Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. Spectrophotometric cell sorter. Science. 156, 1364-1365 (1967).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
- Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
- Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
- US National Research Council. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
- Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
- Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
- Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).
