الإجراءات الجراحية ومنهجية لنموذج الفئران قبل السريرية<em> دي نوفو</em> سرطان الثديي الانبثاث
Summary
نماذج ما قبل السريرية تقييم العلاج المساعد استهداف ورم خبيث سرطان الثدي تفتقر. لمعالجة هذا، قمنا بتطوير نموذج الفئران من دي نوفو الرئوي الانبثاث غدي الثديية، حيث العلاجات التي تدار في وضع مساعد (بعد استئصال الجراحي للأورام الأولية) يمكن تقييمها لفعالية في التأثير الانبثاث الرئوي المصنف سابقا.
Abstract
A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.
Introduction
النساء في أمريكا الشمالية لديهم خطر عمر٪ 12 ~ لتطوير سرطان الثدي 2 ؛ فإن الغالبية العظمى من هؤلاء الأفراد سوف يكون الأورام الأولية إزالتها عن طريق الجراحة، واعتمادا على نوع فرعي السرطان، وبعد ذلك تلقي المستهدفة والغدد الصماء، تشيمو و / أو العلاج الإشعاعي في إعداد مساعد 3 . ومن الأمثلة على ذلك، النساء المشخصات بسرطانات إيجابية مستقبلات هرمون تلقي علاجات مضادة للإستروجين والنساء مع الأورام HER2 إيجابية تلقي العلاجات المستهدفة HER2 مع الإشعاع / العلاج الكيميائي، في حين لا توجد علاجات المستهدفة متوفرة حتى الآن للأورام السالبة الثلاثي 3 . على الرغم من التقدم في العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي والعلاجات الشخصية المعتمدة على الهرمونات التي تكمل الاستئصال الجراحي، يتكرر المرض في 30-70٪ من النساء المشخصات مع المرحلة الثانية أو الثالثة المرض 4 ، والعلاج غير فعالة إلى حد كبير في القضاء على المرض النقيلي في الأعضاء البعيدة، بما في ذلك الرئة، العظام، bالمطر و / أو الكبد 5 . وهذا أمر مهم بشكل خاص نظرا لأنه عندما يحدث المرض النقيلي في غياب نمو الورم الأولي، وهذا يعني أن الخلايا الخبيثة نشرها من المرجح أن تكون موجودة بالفعل في الأعضاء الثانوية في وقت الجراحة النهائية. وبالتالي هناك حاجة ملحة للعلاجات القادرة على استئصال أو بطء نمو الأورام النقيلي.
في حين أن نماذج دي نوفو الماوس من مسرطنة الثديية كانت مفيدة بشكل ملحوظ في الكشف عن آليات تنظيم تطور الورم 1 ، النماذج الموجودة لديها أيضا العديد من القيود. واحدة من هذه هي أن النماذج المعدلة وراثيا دي نوفو عادة تطوير الأورام الأولية في الغدد الثديية متعددة، حيث عبء الورم الأساسي يحد من مدة الدراسات. في حين أن هروب الخلايا السرطانية الأولية والبذر المنتشر من المحتمل أن يحدث في وقت مبكر في تطور الورم في هذه النماذج، والتنمية الصريحة للأورام النقيلي يحدث في وقت متأخر، واعتماد سن نموذج الفأر وخلفية سلالة، وغالبا ما اختراق جزئيا 1 . وهذا يزيد من الحد من فائدة نماذج دي نوفو لاكتشاف الجزيئات التي تنظم الانبثاث في الأعضاء الثانوية، وتقييم الفعالية قبل السريرية من العلاجات في إعداد مساعد.
للتحايل على هذه القيود، قمنا بتطوير نموذج جديد دي نوفو من ورم خبيث سرطان الثدي إلى الرئتين. الوراثة المعدلة وراثيا الإناث ( أي متف-بيمت على خلفية ففب / ن سلالة للدراسات الموصوفة هنا) التي تحمل أواخر مرحلة دي نوفو الأورام الثديية تتراوح أعمارهم بين ~ 100 أيام 6 ، وعند هذه النقطة يتم استئصال أورامها الأولية جراحيا وانفصل إنزيميا إلى تعليق خلية واحدة. يتم تعليق تعليق (1 × 10 6 خلايا) بدورها أورثوتوبيكالي في 6-7 أسبوع المستلم الفئران الإناث المتجانسة، حيث تتطور الأورام الثديية الأولية واحدة على مدى فترة 38 إلى 60 يوما ( <strong كلاس = "زفيغ"> الشكل 1A). في حجم الورم المحدد (172 إلى 450 مم 3 )، يتم تخدير الفئران المتلقي والأورام الأولية يتم استئصالها جراحيا بحيث يتم تصغير نمو الورم في الموقع الجراحي، بما يتفق مع الجراحة في النساء ( الشكل التكميلي 1 ). على خلفية ففب / ن سلالة، الفئران تطوير نسيجيا البؤر النقيلي في الرئتين مع 45٪ اختراق من قبل ~ 115 يوما بعد الجراحة ( الشكل 1B ). مع هذا الكمون ممتدة من نمو الورم النقيلي، ويتم وضع نموذج فريد لتقديم العلاج المساعد، ولتوضيح وتقييم البيولوجيا الأساسية التي تؤثر على التقدم النقيلي بعد الاستئصال الجراحي للأورام الأولية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعديلات وتحري الخلل وإصلاحه:
عندما تشريح الورم حادة بعيدا عن جدار البطن، قد يبقى الورم ملتصقا جدار البطن. وقد لوحظ هذا في <5٪ من الفئران حقن مع ورم (لا تظهر البيانات). للفئران مع الأورام ملتصقة بجدار البطن، والفأر يجب ا…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون جو هيل للمساعدة في علم الأنسجة، والدكتور جون غليستين لتدريس تقنية الجراحة، تيسا ديبيل للمساعدة في التصوير بالفيديو، وجميع أعضاء مختبرات وونغ وكوسنز للحصول على البصيرة والنقاشات الحرجة، ومعهد أوسسو كنيت كانسر للحصول على الدعم المالي. يقر المؤلفون الدعم من T32GM071388-10 و T32CA106195-11 إلى سيغ، نسي / نيه، وزارة الدفاع برنامج أبحاث سرطان الثدي، ومؤسسة سوزان G كومين، ومؤسسة أبحاث سرطان الثدي، والوقوف إلى السرطان – مؤسسة لوستغارتن سرطان البنكرياس التقارب فريق الأحلام منحة البحوث الانتقالية (SU2C-آكر-DT14-14) لمك، ودورة صحة المرأة دائرة إعطاء جائزة ل مهو، ومركز بريندن كولسون للصحة البنكرياس ل مهو و لمك.
Materials
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
Referenzen
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Howlader, N. N. A., Krapcho, M. . SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. , (2011).
- National Comprehensive Cancer Network. . Breast Cancer (Version 3.2014). , (2016).
- Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).
- Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R. . Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine. , (2003).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).
- Kouros-Mehr, H., et al. GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model. Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Qian, B. Z., et al. FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis. J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).
- Verkooijen, H. M., et al. Patients’ refusal of surgery strongly impairs cancer survival. Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).
- Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis. Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
