Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van<em> De Novo</em> Maagkanker Metastase
Summary
Preklinische modellen die adjuvante therapie beoordelen die gericht zijn op metastase van borstkanker, ontbreken. Om dit aan te pakken, ontwikkelden we een muizenmodel van de novo pulmonale mammary adenocarcinoma metastase, waarbij therapieën toegediend in de adjuvante omgeving (post-chirurgische resectie van primaire tumoren) kunnen worden geëvalueerd voor werkzaamheid bij het beïnvloeden van eerder gecoede pulmonale metastasen.
Abstract
A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.
Introduction
Vrouwen in Noord-Amerika hebben een levensduur van 12% voor het ontwikkelen van borstkanker 2 ; Een meerderheid van deze personen zullen primaire tumoren hebben verwijderd via de operatie, en afhankelijk van het subtype van kanker, krijgen dan gerichte, endocriene, chemo- en / of stralingstherapie in de adjuvante instelling 3 . Voorbeelden zijn onder meer vrouwen met hormoonreceptor-positieve kanker die anti-oestrogeen therapieën ontvangen en vrouwen met HER2-positieve tumoren die HER2-gerichte therapieën ontvangen met straling / chemotherapie, terwijl er nog geen gerichte therapieën beschikbaar zijn voor drievoudige negatieve tumoren 3 . Ondanks de vooruitgang in straling, chemotherapie, gepersonaliseerde en hormoon gebaseerde therapieën die chirurgische resectie aanvullen, komt de ziekte terug bij 30-70% van de vrouwen die gediagnosticeerd zijn met fase II of III-ziekte 4 , aangezien therapieën grotendeels ondoeltreffend zijn bij het uitroeien van metastatische ziekte in verre organen, waaronder Long, bot, bRegen en / of lever 5 . Dit is vooral belangrijk gezien het feit dat wanneer metastatische ziekte optreedt bij afwezigheid van primaire tumor hergroei, dit impliceert dat verspreide kwaadaardige cellen waarschijnlijk al in secundaire organen aanwezig waren op het moment van definitieve operatie. Dientengevolge zijn therapieën die de groei van metastatische tumoren kunnen uitroeien of vertragen, dringend nodig.
Terwijl de novo- muismodellen van mammary carcinogenese opvallend informatief zijn bij het onthullen van mechanismen die neoplastische progressie 1 regelen, hebben bestaande modellen ook verschillende beperkingen. Een hiervan is het feit dat transgenische modellen van de novo doorgaans primaire tumoren ontwikkelen in meervoudige borstklippen, waarbij de primaire tumorbelasting de duur van de studies beperkt. Terwijl primaire tumorcel ontsnappen en metastatische zaaien zich waarschijnlijk vroeg in neoplastische progressie in deze modellen voordoen, komt de franke ontwikkeling van metastatische tumoren te vroeg voor en hangt er af van oN het muismodel en de achtergrond van de stam, is vaak gedeeltelijk penetrant 1 . Dit beperkt verder het nut van de novo modellen voor het ontdekken van moleculen die de metastase reguleren in secundaire organen en voor het evalueren van de preclinische werkzaamheid van de therapeutica in de adjuvante omgeving.
Om deze beperkingen te omzeilen, ontwikkelden we een de novo autochthonisch model van mammary carcinoom metastase naar longen. Oudertransgene vrouwen ( dwz MMTV-PyMT op de FVB / n-stamachtergrond voor studies die hierin beschreven zijn) met een latere stadium de novo- mammatumoren zijn ouder tot ~ 100 dagen 6 , op welk punt hun primaire tumoren chirurgisch worden gerececteerd en enzymatisch gedisocieerd in Enkelcel suspensies. Suspensies (1 x 10 6 cellen) worden op hun beurt orthotopisch geëxplanteerd in 6-7 weken oude ontvanger syngeneuze vrouwelijke muizen, waar enkele primaire mammertumoren zich ontwikkelen over een periode van 38 tot 60 dagen ( <stronG class = "xfig"> Figuur 1A). Bij een gedefinieerde tumorgrootte (172 tot 450 mm 3 ) worden ontvanger muizen verdoofd en worden primaire tumoren chirurgisch geresecteerd, zodat tumorhergroei op de chirurgische plaats minimaal is, consistent met de operatie bij vrouwen ( aanvullend figuur 1 ). Op de FVB / n stamachtergrond ontwikkelen muizen histologisch detecteerbare metastatische foci in de longen met 45% penetratie door ~ 115 dagen na de operatie ( Figuur 1B ). Met deze uitgebreide latentie van metastatische tumorgroei is het model uniek gepositioneerd voor adjuvante therapieafgifte en voor het ophelderen en evalueren van onderliggende biologie die de metastatische progressie beïnvloeden na chirurgische verwijdering van primaire tumoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wijzigingen en probleemoplossing:
Wanneer de tumor uit de buikwand los komt, kan de tumor aan de buikwand vasthouden. Dit werd waargenomen bij <5% muizen geïnjecteerd met tumor (gegevens niet getoond). Voor muizen met tumoren die aan de buikwand hechten, moet de muis worden geëuthaniseerd, omdat resectie moeilijk is zonder primaire tumor hergroei.
Beperkingen van model / techniek:
Terwijl andere …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Jo Hill voor histopathologische bijstand, dr. John Gleysteen voor instructie in chirurgische techniek, Tessa Diebel voor videografische bijstand, alle leden van de laboratoria Wong and Coussens voor kritisch inzicht en discussies, en het OHSU Knight Cancer Institute voor financiële steun. De auteurs erkennen steun van T32GM071388-10 en T32CA106195-11 aan CEG, de NCI / NIH, het Ministerie van Defensie Borstkanker Onderzoeksprogramma, de Susan G Komen Foundation, de Stichting Stichting Borstkanker en een Staan op Kanker – Stichting Lustgarten Pancreatic Cancer Convergence Dream Team Translational Research Grant (SU2C-AACR-DT14-14) aan LMC, een Women's Health Circle of Foundation Foundation Award voor MHW, en het Brenden-Colson Center voor Pancreatic Health aan MHW en LMC.
Materials
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
Referenzen
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Howlader, N. N. A., Krapcho, M. . SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. , (2011).
- National Comprehensive Cancer Network. . Breast Cancer (Version 3.2014). , (2016).
- Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).
- Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R. . Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine. , (2003).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).
- Kouros-Mehr, H., et al. GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model. Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Qian, B. Z., et al. FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis. J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).
- Verkooijen, H. M., et al. Patients’ refusal of surgery strongly impairs cancer survival. Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).
- Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis. Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
