Chirurgische Verfahren und Methodik für ein präklinisches Murine - Modell von<em> De Novo</em> Mamma Krebs Metastase

Summary

Präklinische Modelle, die eine adjuvante Therapie mit Brustkrebs-Metastase auswerten, fehlen. Um dies zu lösen, entwickelten wir ein murines Modell der de novo pulmonalen Mamma-Adenokarzinom-Metastase, wobei Therapien, die in der adjuvanten Einstellung (postchirurgische Resektion von Primärtumoren) verabreicht werden, auf die Wirksamkeit bei der Auswirkung von zuvor gesäten pulmonalen Metastasen untersucht werden können.

Abstract

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Introduction

Frauen in Nordamerika haben ein ~ 12% lebenslanges Risiko der Entwicklung von Brustkrebs ² ; Eine Mehrheit dieser Personen wird primäre Tumore über die Operation entfernt haben, und je nach Krebs Subtyp, wird dann erhalten gezielte, endokrine, Chemo- und / oder Strahlentherapie in der adjuvanten Einstellung ³ . Beispiele umfassen, mit Hormonrezeptor-positiven Tumoren diagnostizierten Frauen HER2-zielgerichteten Therapien mit Bestrahlung / Chemotherapie, während keine zielgerichteten Therapien noch verfügbar sind für triple negative Tumoren ³ Empfangen anti-Östrogen – Therapien und Frauen mit HER2-positiven Tumoren erhalten. Trotz Fortschritten in der Strahlung, Chemotherapie, personalisierte und Hormon-basierte Therapien, die chirurgische Resektion ergänzen, wiederholt sich die Krankheit bei 30-70% der Frauen, die mit der Stufe II oder III-Krankheit ⁴ diagnostiziert wurden, da Therapien bei der Beseitigung der metastatischen Erkrankung in entfernten Organen weitgehend unwirksam sind Lunge, Knochen, bRegen und / oder Leber ⁵ . Dies ist besonders bedeutsam, da bei der Metastasierung in Abwesenheit eines primären Tumorwachstums dies impliziert, dass disseminierte maligne Zellen wahrscheinlich bereits in sekundären Organen zum Zeitpunkt der endgültigen Operation vorhanden waren. So sind dringend Therapien erforderlich, um das Wachstum von metastatischen Tumoren zu beseitigen oder zu verlangsamen.

Während de novo Mausmodelle der Brustkarzinogenese bemerkenswert informativ bei der Aufdeckung von Mechanismen zur Regulierung der neoplastischen Progression ^{1 sind} , haben bestehende Modelle auch mehrere Einschränkungen. Eines davon ist die Tatsache, dass de novo transgene Modelle typischerweise Primärtumore in multiplen Brustdrüsen entwickeln, wobei die primäre Tumorbelastung die Dauer der Studien begrenzt. Während primäre Tumorzell-Flucht und metastatische Seeding wahrscheinlich früh in der neoplastischen Progression in diesen Modellen auftreten, entsteht eine offene Entwicklung von metastatischen Tumoren spät, und je nach oN der Maus Modell und Belastung Hintergrund, ist oft teilweise durchdringend ¹ . Dies begrenzt den Nutzen der de novo- Modelle zur Entdeckung von Molekülen, die die Metastasierung in sekundären Organen regulieren, und zur Bewertung der präklinischen Wirksamkeit von Therapeutika in der adjuvanten Umgebung.

Um diese Einschränkungen zu umgehen, entwickelten wir ein de novo autochthones Modell der Mamma-Karzinom-Metastase in die Lunge. Parentale transgene Weibchen ( dh MMTV-PyMT auf dem FVB / n-Stammhintergrund für hierin beschriebene Studien), die Spätstadium de novo Mamma-Tumoren tragen, sind bis zu 100 Tage ⁶ gealtert, wobei zu diesem Zeitpunkt ihre primären Tumoren chirurgisch reseziert und enzymatisch dissoziiert werden Einzelzelle Suspensionen. Suspensionen (1 x 10 ⁶ Zellen) werden wiederum orthotopisch in 6-7-wöchige Empfänger-syngene weibliche Mäuse explantiert, wo sich einzelne primäre Mamma-Tumoren über einen Zeitraum von 38 bis 60 Tagen entwickeln ( <stronG class = "xfig"> Abbildung 1A). Bei einer definierten Tumorgröße (172 bis 450 mm ³ ) werden Empfängermäuse anästhesiert und Primärtumoren werden chirurgisch reseziert, so dass das Tumorwachstum an der chirurgischen Stelle minimiert wird, im Einklang mit der Operation bei Frauen ( Ergänzende Abbildung 1 ). Auf dem FVB / n-Stamm-Hintergrund entwickeln Mäuse histologisch nachweisbare metastatische Herde in der Lunge mit 45% Penetrance um ~ 115 Tage nach der Operation ( Abbildung 1B ). Mit dieser verlängerten Latenz des metastatischen Tumorwachstums ist das Modell eindeutig für die adjuvante Therapieabgabe positioniert und zur Aufklärung und Bewertung der zugrunde liegenden Biologie, die die metastatische Progression nach chirurgischer Entfernung von Primärtumoren beeinflusst.

Protocol

Tiere, die in dem folgenden Protokoll verwendet werden, werden vom Oregon Health & Science University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) abgedeckt, das so konzipiert ist, dass es mit dem Tierschutzgesetz und dem Public Health Service (PHS) -Politik übereinstimmt. Aufrechterhaltung der sterilen Bedingungen: Sterilisierte Instrumente sollten verwendet werden und zwischen Mäusen, sollte mit steriler Gaze abgewischt werden, in PBS gespült, gefolgt von Sterilisation …

Representative Results

Größer als 75% der Empfängermäuse, die 1 x 10 6 Zellen aus primären Mamma-Tumoren erhalten, die von MMTV-PyMT-Mäusen abgeleitet sind, entwickeln einzelne Mamma-Adenokarzinome im Bereich von 172 bis 450 mm 3 innerhalb von 38-60 Tagen (Daten nicht gezeigt). Mäuse, die für eine Randomisierung in Frage kommen, werden dann nach der chirurgischen Resektion von Primärtumoren in die Studiengruppen eingeschrieben ( Abbildung 1C ). Prim?…

Discussion

Änderungen und Fehlersuche:

Wenn der stumpfe Sezierungs-Tumor von der Bauchwand entfernt ist, kann der Tumor an der Bauchwand haften bleiben. Dies wurde bei <5% der mit Tumoren injizierten Mäuse beobachtet (Daten nicht gezeigt). Für Mäuse mit an der Bauchwand anhaftenden Tumoren sollte die Maus euthanasiert werden, da die Resektion ohne primärem Tumorwachstum schwierig ist.

Einschränkungen von Modell / Technik:

<p cl…

Materials

Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800