사후 인간의 두뇌 기증자로부터 Leptomeninges 이식편 문화의 유도
Summary
인간의 사후 뇌에서 leptomeninges 이식편 문화 프로토콜 6-8 주 이내에 피브로넥틴 양성 수막 섬유 아세포를 유도 약 20-30000000 세포를 cryopreserve하기 위해 기술적으로 강력하고 간단한 방법입니다.
Abstract
큰 진전 파킨슨 병의 임상 적 특성에 만들어졌다하더라도, 몇몇 연구는 파킨슨 병의 병리학 적 진단이 임상 진단 파킨슨 병의 최대 25 %에서 확인되지 않은 것을보고한다. 따라서, 티슈는 오진의 높은 속도를 가질 수 특발성 파킨슨 병 환자의 임상 진단에서 수집; 전임상 모델이 쓸데 될 수 따라서 같은 조직에서 시험관 연구에서 파킨슨 병을 연구한다.
파킨슨 병의 확인 신경 병리학 적 진단 사후 인간의 leptomeninges를 수집하고 흑질 선조체 세포 손실과 루이 기관이라는 세포 내 단백질 흠을 특징으로 한 임상 관찰 파킨슨 다른 기저 질환 과정 (예를 들어 종양, 동맥 경화)에 의해 발생한 것이 아닌지 확신 할 수 있습니다.
이 프로토콜 presen해부 및 수막 섬유 아세포 문화의 유도에 대한 사후 인간의 leptomeninges의 준비 TS. 이 절차는 견고하고 높은 성공률을 갖는다. 뇌 조달은 일반적으로 무균 조건 하에서 수행되지 않는 문화의 문제는 불임이다. 따라서, 페니실린, 스트렙토 마이신 및 암포 테리 신 B의 칵테일 배양 배지를 보충하는 것이 중요
파킨슨 병 부검 확인 된 경우에서 수막 섬유 아 세포의 유도는 파킨슨 병의 체외 모델링을위한 기반을 제공합니다. 수막 섬유 아세포는 3~9일 샘플 준비 후 나타나는 약 20-30000000 세포 6-8 주 만에 동결 보존 할 수 있습니다. 수막 섬유 아세포 배양 균질하고 세포 피브로넥틴, 수막을 식별하기 위해 일반적으로 사용되는 마커를 표현한다.
Introduction
뇌경막, 지주막과 피아 이잖아요 : 수막은 뇌를 보호하는 세 개의 막으로 구성되어 있습니다. 최근에, 또한 수막 뇌 발달 한 뇌 항상성에 중요한 역할을한다는 것을 인식하고있다. 수막은 중간 엽 및 신경 능선 유래 세포로부터 유래하고 흥미로운 시험 관내 및 생체 내 2, 3, 4에서의 이식 후 뉴런을 야기 할 수있는 수막에 존재하는 전구 세포를 보였다. 들은 도파민 뉴런 (5)에 배아 줄기 세포의 분화를 위해 간질 세포 유래 유도부 활성을 갖는 수막으로 배양 성공적, 급전 층으로서 사용되어왔다. 또한 leptomeninges 직접 허혈성 조건 하에서 6 뉴런, 아스트로 사이트, 올리고 덴드로 사이트와로 분화 할 수있는 잠재력을 가지고있다.
이 프로토콜의 경우, 인간의 사후 수막 샘플을 총칭하여 지주막과 피아 이잖아요에서 수집 leptomeninges라고, 연구 목적으로 인간의 두뇌 기부의 일환으로 조달된다. 뇌의 해부 죽음의 24 시간 내에서 수행되며,이 프로토콜 여기에 도시 된 바와 같이 leptomeninges 샘플은 다음 6-8 시간 내에서 추가 처리를 위해 저온 성장 배지에 배치된다.
이 프로토콜은 환자의 기본 leptomeninges 세포 배양의 개발에 대한 해부와 인간의 수막 샘플의 준비에 대해 설명합니다. 조직은 약 3mm X 3mm 사각형의 25 ~ 30 조각으로 절단됩니다. 세 가지 각 6 웰에 배치됩니다 젤라틴 코팅 잘 라운드 커버 글라스로 누르고. 뇌막 해부은 약 25 ~ 35 분 소요됩니다. 이 문화의 주요 과제는 뇌 조달, 운송 및 박리 등의 불임은 일반적으로 무균 조건 하에서 수행하지 않는 것입니다. 티herefore, 페니실린, 스트렙토 마이신 및 암포 테리 신 B의 칵테일 배양 배지를 보충하고 별도로 배양 조직 조각을 멀티 웰 접시를 사용하는 것이 중요하다.
수막 섬유 아세포의 부산물은 일반적으로 첫 주 내에서 발생합니다. 세포가 합류 할 때까지 미디어 매 2 ~ 3 일 변화 및 세포 효소 적으로 계대된다. 수막 섬유 아 세포는 냉동 보존 매체에 ㎖ / 바이알 당 100 만 세포의 냉동 보관한다. 이 프로토콜로, 20-30000000 수막 섬유 아 세포는 냉동 보존에 대한 6-8주에서 유도 될 수있다. 이러한 수막 섬유 아세포의 다운 스트림 응용 프로그램은 질병 연구, 직접 신경 세포 분화 또는 질병 메커니즘의 이해 및 약물 개발을위한 leptomeninges에서 유도 만능 줄기 세포의 유도를위한 차 문화입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 뇌 기증과 관련하여 수집 된 인간 사후의 leptomeninges에서 수막 섬유 아세포 문화를 유도하는 간단하고 강력한 프로토콜을 설명합니다. 사후 인간의 물질로 세포 배양을 유도하는 프로토콜의 거의 설명이 있습니다. 두 연구는 피부 유래 섬유 아세포를 배양 7, 8, 9, 한 연구는 경질 샘플 (10)을 설?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson’s Institute Brain Donation Program.
Materials
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Solution | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
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Referenzen
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