Derivación de las leptomeninges de explantes de culturas postmortem Humanos Los donantes de cerebro
Summary
El protocolo de cultivo de explante de leptomeninges cerebral postmortem humana es una forma técnicamente robusto y sencillo para derivar los fibroblastos meníngeos fibronectina positiva dentro de 6-8 semanas y criopreservar aproximadamente 20-30 millones de células.
Abstract
A pesar de que se han hecho grandes avances en la caracterización clínica de la enfermedad de Parkinson, varios estudios indican que el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson no está confirmado patológicamente en hasta el 25% de las enfermedades clínicamente diagnosticados de Parkinson. Por lo tanto, el tejido recogido de pacientes con diagnóstico clínico de enfermedad de Parkinson idiopática pueden tener una alta tasa de diagnóstico erróneo; por lo tanto, en estudios in vitro a partir de tales tejidos para estudiar la enfermedad de Parkinson como un modelo preclínico puede llegar a ser inútil.
Mediante la recopilación de las leptomeninges humanos postmortem con un diagnóstico neuropatológico confirmado de la enfermedad de Parkinson y que se caracteriza por la pérdida de células nigroestriatal y las inclusiones de proteínas intracelulares llamadas cuerpos de Lewy, uno puede estar seguro de que el parkinsonismo clínicamente observada no es causada por otra enfermedad subyacente (por ejemplo, tumores, arteriosclerosis).
Este protocolo presents la disección y preparación de las leptomeninges de cadáver utilizadas para derivación de un cultivo de fibroblastos meníngea. Este procedimiento es robusto y tiene una alta tasa de éxito. El reto de la cultura es la esterilidad como la adquisición cerebro generalmente no se lleva a cabo en condiciones estériles. Por lo tanto, es importante para complementar los medios de cultivo con un cóctel de penicilina, estreptomicina y anfotericina B.
La derivación de los fibroblastos meníngeos de casos confirmados de la autopsia con la enfermedad de Parkinson proporciona la base para el modelado in vitro de la enfermedad de Parkinson. fibroblastos meníngeos aparecen 3-9 días después de la preparación de la muestra y cerca de 20-30 millones de células pueden ser criopreservados en 6-8 semanas. El cultivo de fibroblastos meníngea es homogénea y las células expresan la fibronectina, un marcador utilizado comúnmente para identificar meninges.
Introduction
Meninges consisten en tres membranas que protegen el cerebro: la duramadre, la aracnoides y la piamadre. Más recientemente, se ha reconocido que meninges también juegan un papel importante en el desarrollo del cerebro y el cerebro homeostasis 1. Meninges se derivan de mesenquimales y células derivadas de la cresta neural y de manera interesante, se ha demostrado que las células progenitoras que residen en meninges puede dar lugar a neuronas in vitro y después del trasplante in vivo 2, 3, 4. Culturas Meninges han sido también utilizado con éxito como capas de alimentación, ya que poseen actividad inductora de derivado de células del estroma para la diferenciación de células madre embrionarias en neuronas dopaminérgicas 5. Por otra parte, leptomeninges tienen el potencial de diferenciarse directamente en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos en condiciones isquémicas 6.
Para este protocolo, humanos muestras postmortem meninges se recogen de la aracnoides y la piamadre, llamados colectivamente las leptomeninges, y se adquieren como parte de una donación de cerebro humano con fines de investigación. La disección del cerebro se lleva a cabo dentro de las 24 h de la muerte y la muestra leptomeninges se coloca en medio de cultivo frío para su posterior procesamiento en el próximo 6-8 h como se ilustra aquí en este protocolo.
Este protocolo describe la disección y preparación de muestras meninges humanos para el desarrollo de cultivo de células primarias leptomeninges paciente. El tejido se corta en piezas de aproximadamente 25-30 3 mm x 3 mm cuadrados. Tres piezas se colocan en cada uno de 6 pocillos recubiertos de gelatina bien y se mantiene presionada con cubreobjetos de vidrio redondos. La disección de las meninges toma alrededor de 25-35 minutos. El principal reto con esta cultura es la esterilidad como la adquisición del cerebro, el transporte, y la disección generalmente no se llevan a cabo en condiciones estériles. Tor lo tanto, es importante para complementar los medios de cultivo con un cóctel de penicilina, estreptomicina y anfotericina B y el uso de platos de múltiples pocillos de cultivo de tejidos por separado piezas.
Consecuencia de fibroblastos meníngeos ocurre generalmente dentro de la primera semana. Medios se cambia cada dos o tres días hasta que las células son confluentes y las células se pasan enzimáticamente. Los fibroblastos meníngeos son criopreservados en 1 millón de células por ml / vial en los medios de crioconservación. Con este protocolo, 20-30 millones de fibroblastos meníngeos se pueden derivar en 6-8 semanas para la criopreservación. aplicaciones posteriores de estos fibroblastos meníngeos son cultivos primarios para la investigación de enfermedades, la diferenciación neuronal directa o derivación de células madre pluripotentes inducidas a partir de las leptomeninges para la comprensión de los mecanismos de la enfermedad y para el desarrollo de fármacos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un protocolo simple y robusto para derivar un cultivo de fibroblastos de meníngea leptomeninges postmortem humanos recogidos en conjunción con una donación cerebro. Hay muy pocas descripciones de los protocolos para derivar los cultivos celulares a partir de material humano postmortem. Dos estudios describen cultivos de fibroblastos 7, 8, de la piel derivado de 9, un estudio describe muestras Dura <su…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson’s Institute Brain Donation Program.
Materials
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Solution | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
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Referenzen
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).
- Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
- Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
- Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
- Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
- Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
- Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease–methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
- Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).
- Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).
- Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson’s disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson’s disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
- Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779 (2013).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson’s patient’s iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).
- Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson’s disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
- Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson’s disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).
