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Biotechnik

病毒衍生肽修饰抗体结合物对增强细胞积累和改善肿瘤靶向性的初步评价

Published: March 08, 2018
doi:
10.3791/55440
, , , , , ,
1Department of Nuclear Medicine and Radiobiology,Université de Sherbrooke, 2Sherbrooke Molecular Imaging Center (CIMS),Université de Sherbrooke, 3Sherbrooke Institute of Pharmacology

Summary

病毒衍生肽与抗体结合 (ACs) 是一种获得动力的方法, 由于可能提供的分子负载增加肿瘤细胞积累。利用常用的方法来评估肽共轭、AC 和有效载荷的胞内积累和肿瘤靶向, 这项协议帮助研究人员在关键的初步发展阶段。

Abstract

用病毒衍生肽修饰的抗体共轭物 (acs) 是一种潜在强大的肿瘤细胞传递剂, 用于癌症治疗和影像学的分子有效载荷, 原因是细胞积累超过了目前的 ACs。在早期交流体外开发过程中, 荧光技术和 radioimmunoassays 对确定细胞内定位、积累效率和靶细胞特异性都有足够的作用。目前, 对于制备细胞以评价交流细胞内聚集和定位的标准化方法尚无共识。对使用病毒衍生肽进行修饰的 ACs 的初步测试是至关重要的, 特别是如果已经建立了几个候选者。通过荧光法测定细胞内的细胞积累, 可影响其表面的背景信号, 使堆积物的解释复杂化。对于 radioimmunoassays, 通常被处理的细胞被分割, 并测量不同细胞间的放射性。然而, 细胞裂解从细胞到细胞不同, 通常细胞核和细胞质隔间没有充分的隔离。这可能会产生关于负载传递属性的误导性数据。核素病毒衍生肽修饰 ACs 在肿瘤荷载小鼠中的静脉注射和核素显像是确定肿瘤靶向和有效载荷传递特性的有力方法, 在体内阶段发展.然而, 这是一个相对较新的进展, 很少有团体以这种方式评估病毒衍生的肽修饰 ACs。我们描述治疗细胞的处理, 以更准确地评估病毒衍生的肽修饰交流积累时, 使用共焦显微镜和 radioimmunoassays。具体地说, 一种 trypsinizing 单元格移除单元格表面绑定 ACs 的方法。我们还提供了一种改善细胞分馏的方法。最后, 本协议提供了一个体内方法, 使用正电子发射断层扫描 (PET) 评估肿瘤小鼠的初始肿瘤靶向性。我们使用放射性同位素64Cu (t1/2 = 12.7 h) 作为本协议中的一个示例负载。

Introduction

抗体共轭 (ACs) 是生物成熟成为一个转化类的有效药物改善癌症治疗和检测肿瘤。ACs 由与分子有效载荷 (如放射性同位素、小分子和生物毒素) 共轭的单克隆抗体组成, 能够将这些有效载荷传递给具有精致靶抗原亲和性和特异性的癌细胞。因此 ACs 有可能显著减少非特异性毒性, 并增加肿瘤部位的有效载荷活动。治疗, ACs 运输细胞毒性小分子 (通常称为抗体-药物共轭) 已被批准处理乳腺癌和霍奇金淋巴瘤谁已经失败常规治疗1,2. 此外, 运输放射性同位素 (通常称为 radioimmunoconjugates) 的 ACs 也在开发中。通过交流传输放射性同位素进行成像, 确认前列腺癌转移3。随着更多的治疗 acs 提交批准4, 乐观是高的未来 acs, 以改善癌症护理5。

然而, 在运送化疗或放射性同位素时, ACs 很难有效地在靶细胞内积聚这些有效载荷。在许多情况下, 这方面显著地有助于 ACs 无法提供持久无疾病生存或高对比度肿瘤成像6,7。一般而言, 一旦 ACs 结合其目标抗原, 它们就会通过称为受体介导的吞的过程内部化。然后, ACs 被包裹在内涵体内并被贩运到溶酶体中, 用于降解和有效载荷释放 8. 细胞内的贩运过程给 ACs 带来了挑战, 以达到高有效载荷特异性和抗靶向癌细胞的功效。例如, 许多抗原, 如 Her2 (治疗交流曲妥珠单抗-emtansine 靶) 可以在前 30分钟9 中回收多达85% 的绑定抗体。此外, 一旦降解发生, 释放的化疗和放射性同位素可以通过增加表达和/或活动的膜相关传输蛋白10,11积极出口。溶酶体的降解也阻碍了新的生物有效载荷的传递, 如治疗酵素和寡核苷酸, 可以被停用12,13。从本质上讲, 癌细胞是高效的废除细胞内积累的有效载荷由 ACs 提供。

该协议描述了如何实现 ACs-耦合到病毒衍生肽的概念, 特别是为了逃避 endosome 诱捕和本地化到细胞核。这种复杂的操作宿主细胞系统, 这并不奇怪, 病毒衍生蛋白和肽作为潜在的生物的发展早已根深蒂固的治疗研究14。为了有效地进入宿主细胞, 在数以百万年的时间里, 病毒进化来获得一种特殊的蛋白质集合, 能够利用正常的生理哺乳动物细胞系统。对于通过受体介导的吞内化的病毒, 他们也面临着逃避贩运到溶酶体的挑战, 那里的蛋白酶局部浓度的冲击可能会对生存有问题。一种具有良好特征的病毒衍生肽, 用于药物的传递, 以逃避 endosome 诱捕是人体免疫机能丧失病毒 transactivator 转录 (达) 蛋白15。达能通过传感低 pH 值来逃避 endosome 诱捕, 在这种情况下, 蛋白质构象的变化发生, 使达能够插入和扰乱细胞膜膜16。这就产生了能进入细胞质的达-负载共轭物。与此协议相关的第二个病毒操作元素是用于将治疗基因和药物传递给核的方法17。病毒已经进化到成功地操纵宿主细胞机械, 通过核孔复合体通过核膜的进展。蜂窝大分子包含 (或结合含有的蛋白质) 核定位信号 (NLSs), 以绑定到核转运蛋白 (例如karyopherins α和β), 通过 NPC 提供必要的运动。病毒已经开发出含有 NLS 序列的蛋白质, 使它们能够利用宿主细胞传输蛋白来传送到细胞核18。

许多 ACs 以前已经功能性与达-和 NLS 衍生肽, 并测试他们的能力积累在癌细胞和靶向肿瘤19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (表 1)。提供细胞毒性有效载荷的研究表明, 通过病毒衍生肽进行修饰的 acs 能够显著增加细胞积累、细胞毒性和肿瘤死亡, 超过未修改的 ACs 22,26。这个新的交流类的一个共同特点是他们的建设。通常情况下, 多肽含有一个末端半胱氨酸, 提供游离巯基。抗体首先反应的是 noncleavable 双交联剂, 其中包含N-琥珀 (NHS) 和 maleimide 组在相反的一端。NHS 酯在单克隆抗体上与主要胺反应形成酰胺键。与自由 maleimide 组的反应, 然后反应与巯基组对肽形成一个硫酯键, 从而连接肽和单克隆。虽然同型交联剂已使用 28, 但 heterobifunctional 交联剂更常用于构建病毒衍生肽–ACs22,23,26, 31,32。本议定书特别使用交联 sulfosuccinimidyl 4-(n-马来) 环己烷-1-羧酸酯 (磺当局), 以便于使用, 因为它被用于经批准的抗体-药物共轭曲妥珠单抗-emtansine, 在许多病毒衍生肽-ACs 8,22,23,26,31,32。月桂酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS 页) 是初步确定共轭效率和半定量的多肽每单克隆的主要方法。共焦显微术使用荧光标记的二次抗体特定于单克隆, 通常是初步评价病毒衍生肽修饰 ACs 细胞内分布特性的方法。迄今为止, 放射性同位素是由病毒衍生的肽修饰 ACs 提供的主要有效载荷。放射性同位素是有利的, 因为细胞中的放射性可以很容易地通过伽玛计数来量化。此外, 被翻译成老鼠的人类癌症模型的 ACs 为研究人员提供了评估肿瘤靶向性的能力, 例如单光子发射计算机断层扫描和正电子发射层析成像 (PET)。23,32,33. 一般而言, 研究人员主要使用的构造和验证测试方法为在初始开发阶段对病毒衍生肽进行了改进的 ACs 提供了很好的评估, 以便有效地进入和交付靶细胞内的有效载荷和靶向肿瘤。

达-和 NLS 修饰的 ACs 已经照亮了进一步改善肿瘤细胞和肿瘤内有效载荷的关键领域。关于 NLS 修改的 ACs, 细胞内积累的效率可以是适度的23,31,34。细胞内积聚效率低下是由持续的细胞膜诱捕引起的。在体内肿瘤靶向也可以减少与达-和 NLS 修改 ACs。有效序列的达和 NLS 含有几个正电荷残留物。当附加到抗体时, 总阳离子电荷可以显著增加35。因此, 经和 NLS 改良的 ACs 增加了对健康组织的吸收, 并增加了快速的血液清除量。

我们的小组开发了一个复合化合物组成的胆酸与 NLS (ChAcNLS;图 1)。ChAcNLS 修饰的 acs 能够增加所提供的放射性同位素的胞内积累和改善肿瘤靶向性, 与 NLS 修改和传统 ACs 33,34。胆酸的机制是由选择 nonenveloped 病毒的能力所激发的, 不能依靠膜融合来利用胆酸通过神经酰胺的形成来触发 endosome 逃逸。例如, 猪肠道病毒新兵胆酸激活 sphingomyelinase, 催化鞘磷脂水解成神经酰胺 36, 37, 38. 这破坏细胞膜膜, 并允许病毒逃逸。因此, 胆酸是另一个病毒衍生成分, 补充 NLS。

随着这一领域的向前推进和未来的进步发生在负载交付由 ACs 修改与病毒衍生肽, 这是一个适当的时间来提供视觉示范其生物化学和功能特性的初步发展。在这里, 我们描述我们的协议, 初步评估病毒衍生肽修饰 ACs 的有效而简单的确定细胞内积累和肿瘤靶向在早期发展。我们使用商业上可用的抗体7G3 和 A14 作为示例模型系统。步骤1描述了使用 SDS 页作为一种方法, 允许对构造的 ACs 进行 “转/不走” 决策。程序2描述了一种使用 trypsinization 的方法, 用于改善交流细胞内分布和积累的可视化。步骤3描述了一种改进细胞内分馏的方法, 以准确确定核定位。在这个过程中, 我们利用负载64Cu (t1/2 = 12.7 h), 因为它易受细胞外流, 是正电子发射器10。因此, 程序4描述了在体内肿瘤靶向特征的 PET 成像, 以可视化肿瘤摄取相对于背景 (即nontarget 健康组织), 并确定该例交流是否可以具体和有效地靶向肿瘤。这些方法足以为研究人员开发的 ACs 修改与病毒衍生肽, 以确定候选者进一步提高。

Protocol

所描述的体内动物实验是根据一项经批准的议定书和中心 Hospitalier Universitaire de 舍布鲁克伦理学委员会动物实验的道德准则进行的。 1. 抗体肽共轭 注: ChAcNLS 可在任何商业肽制造商或大学附属的多肽综合服务平台上合成。ChAcNLS 的合成可以在参考34中找到。对于程序1和2使用单克隆 7G3, 这是特定的白血病抗原 IL-3Rα 39</sup…

Representative Results

在程序1中, 用磺当局作为交联剂 ChAcNLS 改性7G3 的结构是非常可靠的。通常, 当加载到12% 凝胶和分析的 SDS 页, 这导致可区分逐步增加兆瓦比例增加 sulfo-SMCC-to-7G3 比率使用, 并允许重和轻链单独评估 ChAcNLS共轭 (图 3)。7G3 反应在 10, 20, 25 和50到 1 sulfo-SMCC-to-7G3 比率跟随射频测量和兆瓦推断结果在 3, 7, 10 和 20 ChAcNLS 分子每7G3。通过密度测定, 7G3 3-10 ChAcNLS, 单体的百?…

Discussion

系统地提供抗癌药物的主要目标是增加肿瘤部位的积聚, 并在癌细胞中吸收, 并减少健康组织中有害的副作用。交流靶向肿瘤细胞提供分子有效载荷是一种非常有前景的治疗和检测肿瘤的方法。然而, endosome 和下游溶酶体退化所引起的疗效仍然是一个重要的挑战。虽然该协议利用 ChAcNLS 肽作为下一代 ACs 的一个例子, 但所描述的程序可以适应任何被开发的多肽修饰交流, 目的是增加细胞内交付的负载?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作由癌症研究协会 (加拿大) 和 CIMS 资助。作者感谢 Samia 博士 Mohand 和吉恩-弗朗索瓦 Beaudoin 的帮助。天使洛佩兹博士 (南澳大利亚大学) 为单克隆 A14。

Materials

Sulfo-SMCC Thermo Scientific 22122 There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters EMD Millipore UFC505096 There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards BioRad 1610375EDU Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Thermo Scientific A-21235 1-10 μg/mL recommended
NOTA-NHS CheMatech C100
Lamin A/C antibody (N-18) Santa Cruz Biotechnology sc-6215
Rab7 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376362
A14 mAb BD Biosciences 555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermo Scientific NP0007
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-25ML
TF-1a cells ATCC ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium ATCC ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer Thermo Scientific 89900
AMIDE medical imaging software available at amide.sourceforge.net Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope Olympus
Fluoview Software Olympus www.olympus-lifescience.com
ITLC strips Biodex 150-771
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Keywords: Antibody-conjugatesViral-derived PeptidesCellular AccumulationTumor TargetingPET ImagingNuclear LocalizationTF1A CellsColic-acidMonoclonal AntibodiesTrypsinEDTARPMI1640PFASucroseTriton X-100Alexa Fluor 647
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Beaudoin, S., Paquette, M., Fafard-Couture, L., Tremblay, M. A., Lecomte, R., Guérin, B., Leyton, J. V. Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting. J. Vis. Exp. (133), e55440, doi:10.3791/55440 (2018).
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