Avaliação inicial do anticorpo cojugado modificado com peptídeos virais-derivado para aumentar a acumulação celular e melhorando o direcionamento do Tumor

Summary

Peptídeos virais-derivado acoplados ao anticorpo-conjugados (ACs) é uma abordagem ganhando impulso devido ao potencial de entregar cargas moleculares com acumulação de células de tumor aumento. Utilizando métodos comuns para avaliar a conjugação do peptide, AC e acúmulo intracelular de carga e direcionamento do tumor, este protocolo ajuda pesquisadores durante as fases de desenvolvimento inicial chave.

Abstract

Anticorpo-conjugados (ACs) modificados com peptídeos derivados de vírus são uma classe potencialmente poderosa de agentes de entrega de célula de tumor para cargas moleculares, usado no tratamento do câncer e da imagem latente devido ao maior acúmulo celular sobre ACs atual. Durante o início AC em vitro desenvolvimento, técnicas de fluorescência e radioimunoanálises são suficientes para determinar a localização intracelular, eficiência de acumulação e especificidade de célula de destino. Atualmente, não há nenhum consenso sobre métodos padronizados para preparar células para avaliar a localização e o acúmulo intracelular de AC. Os testes iniciais de ACs modificado com peptídeos derivados de vírus é crítico, especialmente se vários candidatos foram construídos. Determinar o acúmulo intracelular por fluorescência pode ser afetada pelo sinal de fundo do ACs na superfície da célula e complicar a interpretação de acumulação. Para radioimunoanálises, células normalmente tratadas são fraccionadas e medido a radioatividade em compartimentos celulares diferentes. No entanto, lysis da pilha variam de célula para célula e muitas vezes nucleares e citoplasmáticos compartimentos não são adequadamente isolados. Isso pode produzir dados enganosos em Propriedades de entrega da carga. A injeção intravenosa de radiolabeled do vírus-derivado do peptide-modificado ACs no tumor ratos seguidos por imagens de radionuclídeos do rolamento é um poderoso método para a determinação de propriedades de entrega de direcionamento e carga de tumor na fase na vivo de desenvolvimento. No entanto, este é um avanço relativamente recente e alguns grupos avaliaram ACs de peptídeo-modificado vírus-derivado dessa maneira. Descrevemos o processamento das células tratadas com mais precisão, avaliar acúmulo de AC de peptídeo-modificado vírus-derivado quando usando radioimunoanálises e microscopia confocal. Especificamente, um método para células trypsinizing remover a superfície da célula vinculada ACs. Nós também fornecemos um método para melhorar o fracionamento celular. Por último, este protocolo fornece um método no vivo usando tomografia por emissão de pósitrons (PET) para avaliar o tumor inicial direcionamento Propriedades em camundongos tumor-rolamento. Nós usamos o radioisótopo ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12,7 h) como uma carga de exemplo neste protocolo.

Introduction

O-anticorpo cojugado (ACs) é produtos biofarmacêuticos que estão amadurecendo em uma classe de transformação de medicamentos eficazes para melhorar os tratamentos contra o cancro e para a detecção de tumores. Composto por um anticorpo monoclonal (mAb) conjugado com cargas moleculares como radioisótopos, pequenas moléculas e toxinas biológicas, ACs é capaz de entregar estas cargas para as células cancerosas com afinidade de antígeno alvo requintado e especificidade. Assim, ACs têm o potencial para reduzir a toxicidade inespecífica significativamente e aumentar a atividade de carga no local do tumor. Terapeuticamente, ACs transportar moléculas pequenas citotóxicas (comumente referidas como droga-anticorpo cojugado) foram aprovados para o tratamento de pacientes com câncer de mama e linfoma de Hodgkin que falharam os tratamentos convencionais ^{1, 2}. Além disso, radioisótopos de transporte ACs (comumente referidos como radioimmunoconjugates) também estão em desenvolvimento. Uma AC transportando um radioisótopo para a imagem latente é aprovada para a identificação de metástase de câncer de próstata ³. Com muitos ACs mais terapêutico apresentado para aprovação ⁴, otimismo é alto para o futuro da ACs para melhorar os cuidados de câncer ⁵.

No entanto, quando entregando chemotherapeutics ou radioisótopos, ACs têm dificuldade em efetivamente acumulando estas cargas no interior das células alvo. Este aspecto contribui significativamente em muitos casos, na incapacidade de ACs para proporcionar a sobrevivência livre de doença de longa duração ou tumor de alto contraste de imagem ^6,7. Em geral, uma vez que o ACs vincular seu antígeno alvo eles são internalizados através de um processo conhecido como endocitose mediada por receptores. O ACs são então aprisionado dentro endossomos e traficadas para lisossomos para degradação e carga versão ⁸. O processo de tráfico intracelular coloca desafios ACs alcançar uma carga alta especificidade e eficácia contra as células cancerosas do alvo. Por exemplo, muitos antígenos como Her2 (alvo terapêutico para AC Trastuzumab-emtansine) pode reciclar até 85% dos anticorpos ligados na primeira 30 min ⁹. Além disso, uma vez que a degradação ocorre, chemotherapeutics lançado e radioisótopos podem ser ativamente exportados pela expressão aumentada e/ou atividade de transporte de membrana associada a proteínas ^10,11. Degradação do lisossoma impede também a entrega de cargas biológicas novela tais como enzimas terapêuticas e os oligonucleotides que podem ser desativado ^12,13. Em essência, a célula cancerosa é altamente eficaz em que revoga o necessário acúmulo intracelular de cargas entregado pelo ACs.

Este protocolo descreve como implementar o conceito de ACs-acoplado a peptídeos derivados de vírus, especificamente para escapar de uma armadilha do endossomo e localizando para o núcleo da célula. Com tal sofisticação para manipular sistemas de células do hospedeiro, não é surpreendente que o desenvolvimento de vírus-derivado de proteínas e peptídeos como biopharmaceuticals potencial há muito tempo tem sido entranhado em investigação terapêutica ¹⁴. Há milhões de anos vírus evoluíram para adquirir uma excepcional colecção de proteínas capazes de explorar sistemas de células de mamíferos fisiológica normal a fim de efetivamente inserir células hospedeiras. Para vírus que são internalizados através de endocitose mediada por receptores, eles também são desafiados com escapando tráfico para o lisossomo, onde o ataque de uma concentração localizada de proteases pode ser problemático para a sobrevivência. Um peptídeo derivado viral bem caracterizado utilizado na entrega da droga para escapar de uma armadilha do endossomo é a vírus da imunodeficiência humana liberada de transcrição (Tat) proteína ¹⁵. Tat é capaz de escapar de uma armadilha do endossomo por sensoriamento baixo-pH, no ponto em que mudanças conformacionais da proteína ocorrerem habilitação Tat para inserir-se em e romper a membrana de CDDP ¹⁶. Isso resulta em conjugados de Tat-carga capazes de acessar o citoplasma. O segundo elemento de manipulação viral relacionado ao presente protocolo é a abordagem usada para entregar o núcleo ¹⁷genes terapêuticos e drogas. Vírus evoluíram para manipular com êxito a maquinaria de célula hospedeiro para progredir além da membrana nuclear, passando através do poro nuclear complexo (NPC). Macromoléculas celulares contêm (ou ligar-se a proteínas que contêm) um sinal de localização nuclear (NLSs) necessário para a vinculação a nuclear transporte de proteínas (por exemplo, carioferinas α e β), que fornecem os movimentos necessários através do NPC. Vírus desenvolveram-se as proteínas para conter sequências de NLS que proporcionam-lhes a capacidade de utilizar proteínas de transporte celular anfitrião para o vaivém do núcleo de ¹⁸.

Inúmeras ACs anteriormente foram acrescida com Tat e NLS derivada de peptídeos e testado pela sua capacidade de se acumular no interior das células de câncer e para o direcionamento de tumores ^{19,20,21,22 ,23,24,25,26,},^27,28,29,30 (tabela 1). Estudos entregando cargas citotóxicas têm demonstrado que a ACs modificado com peptídeos derivados de vírus são capazes de aumentar significativamente o acúmulo celular, citotoxidade e tumor matando por não modificado ACs ^22,26. Uma característica comum para essa nova classe de AC é sua construção. Normalmente, peptídeos contêm uma cisteína terminal fornecendo um grupo sulfidrila livre. Celia é primeiro reagiu com um crosslinker bifuncional noncleavable contendo N– Hidroxisuccinimida (NHS) e grupos de maleimide em lados opostos. Os ésteres de NHS reagem com aminas primárias sobre o mAb para formar ligações Amida. O mAb reagiram com grupos maleimide livre é então reagiu com os grupos sulfidrila nos peptídeos para formar uma ligação Tioéster e, portanto, vinculando o peptídeo e mAb. Apesar de homobifunctional crosslinkers foram utilizados ²⁸, heterobifunctional reticulador são mais comumente usados na construção de vírus-derivado do peptide-ACs ^{22,23,26, 31,32}. Este protocolo usa especificamente a sulfosuccinimidyl reticulador 4-(N-maleimidomethyl) ciclo-hexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) por sua facilidade de uso e porque ele é usado no conjugado anticorpo-droga aprovada Trastuzumab-emtansine e, em muitos vírus-derivado do peptide-ACs ^{8,22,23,26,31,32}. Eletroforese em gel de poliacrilamida sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE) é o principal método para inicialmente determinar a eficiência de conjugação e semi quantificando o número de peptídeos por mAb. Microscopia confocal usando um fluorescente etiquetado anticorpo secundário específico para o mAb é normalmente o método de avaliação inicialmente Propriedades de distribuição intracelular do vírus derivado do peptide-modificado ACs. Até então, radioisótopos são as cargas primárias entregadas pelo vírus-derivado do peptide-modificado ACs. Radioisótopos são vantajosos porque radioatividade nas células é facilmente quantificada pela contagem de gama. Além disso, a ACs que são convertidos em modelos do rato de cânceres humanos fornecem pesquisadores com a capacidade de avaliar o tumor como alvo usando as modalidades de imagem moleculares, tais como emissão de fóton único computadorizada tomografia computadorizada e tomografia por emissão de pósitrons (PET) ^{23 , 32 , 33}. em geral, a construção e validação de teste métodos utilizados principalmente por pesquisadores fornecem uma avaliação muito boa de ACs modificado com peptídeos derivados de vírus durante a fase inicial de desenvolvimento para efetivamente entrar e entregar o carga no interior das células alvo e para tumores de alvo.

TAT e NLS-modificado ACs tem iluminadas áreas-chave para melhorar ainda mais a entrega da carga no interior das células de câncer e de tumores. No que diz respeito a ACs NLS-modificado, a eficiência no acúmulo intracelular pode ser modesto ^23,31,34. Acúmulo intracelular ineficiente é causado por uma armadilha CDDP continuado. Na vivo o tumor como alvo pode também ser diminuída com ambos Tat e NLS-modificado ACs. As sequências de ativas de Tat e NIS contêm vários resíduos carregados positivos. Quando anexado a Celia, a carga total catiônica pode ser significativamente aumentada ³⁵. Como consequência, o Tat – e NLS-modificado ACs têm aumentado a captação em tecidos saudáveis e aumentou a liberação rápida de sangue.

Nosso grupo desenvolveu um composto composto consistindo de ácido cólico, ligado à NLS (ChAcNLS; A Figura 1). ACs ChAcNLS modificados são capazes de aumentar o acúmulo intracelular de radioisótopos entregues e melhorar o tumor como alvo em relação ao tradicional e modificado NLS ACs ^33,34. O mecanismo por trás de ácido cólico é inspirado pela capacidade de selecionados vírus nonenveloped que não podemos confiar na fusão da membrana para utilizar ácido cólico para acionar o endossomo fuga através da formação de ceramida. Por exemplo, vírus entéricos porcinos recrutas ácido cólico que ativa o sphingomyelinase, que catalisa a hidrólise de esfingomielina em ceramida ^36,37,38. Isto desestabiliza CDDP membrana e permite a fuga de vírus. Assim, o ácido cólico é outro componente derivado de vírus que complementa o NLS.

Como este campo se move para a frente e futuros avanços ocorrem em entrega de carga pelo ACs modificado com peptídeos derivados de vírus, é um momento oportuno para fornecer demonstrações visuais de suas caraterísticas bioquímicas e funcionais durante o desenvolvimento inicial. Aqui, descrevemos nosso protocolo para a avaliação inicial do vírus derivado do peptide-modificado ACs para a determinação de simples mas eficiente de acumulação intracelular e tumor direcionamento durante o desenvolvimento de fase precoce. Nós usamos o mAbs comercialmente disponível 7 3 e A14 como sistemas modelo de exemplo. Procedimento 1 descreve o uso de SDS-PAGE como um método que permite decisões ‘ir ou não ir’ para ACs construído. Procedimento 2 descreve um método usando tripsinização permitindo a melhor visualização da distribuição intracelular de AC e acumulação. Procedimento 3 descreve um método para fracionamento intracelular melhorado determinar com precisão a localização nuclear. Neste procedimento utilizamos a carga ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12,7 h) porque é vulnerável ao efluxo celular e é um pósitron emissor ¹⁰. Assim, o procedimento 4 descreve na vivo tumor definião caracterização PET imagem para visualizar a captação do tumor em relação ao plano de fundo (ou seja, tecidos saudáveis nontarget) e determinar se o exemplo AC pode especificamente e efetivamente tumores do alvo. Estes métodos são suficientes para investigadores desenvolvendo ACs modificado com peptídeos derivados de vírus para identificar candidatos para mais avanço.

Protocol

Na vivo animais descritos foram realizados experimentos de acordo com um protocolo aprovado e sob as diretrizes éticas do Comitê de ética Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke para experimentos de Animal. 1. anticorpo do Peptide conjugação Nota: ChAcNLS pode ser sintetizado em qualquer fabricante comercial do peptide ou plataforma de serviços de síntese de universidade-affiliated do peptide. A síntese de ChAcNLS pode ser encontrada na referê…

Representative Results

Para o procedimento 1, a construção de 7 3 modificado com ChAcNLS usando sulfo-SMCC como um agente reticulante é muito confiável. Normalmente, quando carregado em um gel de 12% e analisadas por SDS-PAGE, isso resulta em distinguível gradual aumento proporcional ao aumento de rácios de sulfo-SMCC-para – 7 3 MW usado e permite para as cadeias pesadas e leves ser avaliada individualmente para ChAcNLS conjugação (Figura 3). 7G 3 reagiu em 10, 20, 25-e rácios de sulfo…

Discussion

Objetivos principais da entrega sistêmica dos agentes anti-câncer são aumentar a acumulação no local do tumor e absorção dentro de células cancerosas e diminuir efeitos colaterais indesejados em tecidos saudáveis. Entrega de AC alvejado de cargas moleculares de células tumorais é uma abordagem altamente promissor para tratar e detectar tumores. No entanto, a falta de eficácia causada por uma armadilha do endossomo e para baixo de degradação lisossomal fluxo permanece um desafio importante. Enquanto este pro…

Materials

Sulfo-SMCC	Thermo Scientific	22122	There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters	EMD Millipore	UFC505096	There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards	BioRad	1610375EDU	Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Thermo Scientific	A-21235	1-10 μg/mL recommended
NOTA-NHS	CheMatech	C100
Lamin A/C antibody (N-18)	Santa Cruz Biotechnology	sc-6215
Rab7 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376362
A14 mAb	BD Biosciences	555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Scientific	NP0007
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-25ML
TF-1a cells	ATCC	ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium	ATCC	ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer	Thermo Scientific	89900
AMIDE medical imaging software	available at amide.sourceforge.net		Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope	Olympus
Fluoview Software	Olympus		www.olympus-lifescience.com
ITLC strips	Biodex	150-771