Modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra a isquemia cerebral
Summary
O pós-condicionamento ácido protege contra a isquemia cerebral. Aqui apresentamos dois modelos para executar a APC. Eles são obtidos, respectivamente, transferindo fatias corticostriatais para o tampão ácido após a privação de oxigênio-glicose in vitro e pela inalação de 20% de CO 2 após a oclusão da artéria cerebral média in vivo .
Abstract
O acidente vascular cerebral é uma das principais causas de mortalidade e incapacidade em todo o mundo, com abordagens terapêuticas limitadas. Como uma estratégia endógena para a neuroproteção, os tratamentos pós-condicionamento provaram ser terapias promissoras contra a isquemia cerebral. No entanto, procedimentos complicados e possíveis problemas de segurança limitam sua aplicação clínica. Para superar estas desvantagens, desenvolvemos pós-condicionamento ácido (APC) como terapia para isquemia cerebral focal experimental. APC refere-se ao tratamento de acidose leve por inalação de CO 2 durante a reperfusão após isquemia. Aqui apresentamos dois modelos para executar APC in vitro e in vivo , respectivamente. O tratamento de privação de oxigênio-glicose (OGD) de camundongos e a oclusão corticostriatal e oclusão da artéria cerebral média (MCAO) de camundongos foram empregados para imitar a isquemia cerebral. APC pode ser simplesmente conseguido através da transferência de fatias de cérebro para tampão ácido borbulhado com 20% de CO 2 , oR por camundongos que inalam 20% de CO 2 . A APC mostrou efeitos protetores significativos contra a isquemia cerebral, como reflete a viabilidade do tecido e o volume do infarto cerebral.
Introduction
O acidente vascular cerebral é uma das principais causas de mortalidade e incapacidade em todo o mundo. Grandes esforços foram feitos para encontrar tratamentos efetivos para AVC nas últimas décadas, no entanto, a conquista é bastante insatisfatória. O pós-condicionamento é um processo manipulado por tensões subtoxicas após um episódio isquêmico. O pós-condicionamento, incluindo o pós-condicionamento isquêmico, hipóxico, baixo teor de glicose e remoto, desencadeia mecanismos adaptativos endógenos e provou ser terapias promissoras contra a isquemia cerebral 1 , 2 , 3 , 4 . Contudo, o pós-condicionamento isquêmico pode introduzir lesões adicionais. O pós-condicionamento isquêmico remoto dos membros geralmente precisa de vários ciclos de 5 a 20 min de oclusão e reperfusão nos membros traseiros ipsilaterais ou bilaterais 5 , 6 , 7 . ºPortanto, essas manipulações pós-condicionamento são perigosas ou impraticáveis na prática clínica. Para superar essas desvantagens, desenvolvemos APC como terapia para isquemia cerebral focal em camundongos 8 . Induzido simplesmente por inalação de 20% de CO 2 , APC reduz significativamente a lesão cerebral isquêmica de uma maneira mais viável e segura. Recentemente, provamos que a APC estende a janela de reperfusão, destacando o significado da APC para terapia de AVC 9 .
Aqui apresentamos dois modelos experimentais para estudar a neuroproteção de APC contra isquemia cerebral. O primeiro é o modelo de privação de oxigênio-glicose (OGD) em fatias corticostriatais de camundongos. A rápida preparação e transferência das fatias do cérebro para um ambiente artificial, geralmente fluido cerebrospinal artificial (ASCF), pode manter a viabilidade celular e circuitos neuronais, o que possibilita o estudo da função cerebral in vitro 10 <Sup> 11 . OGD em ASCF imita a isquemia cerebral e induz a lesão isquêmica 12 , 13 , 14 . Após OGD, as fatias de cérebro são atualizadas em ASCF (r-ASCF) regulares para fornecer reperfusão e depois tratadas com APC usando ASCF ácido borbulhou com 20% de CO 2 . A fatia corticostriatal mantém a caracterização histológica intacta em comparação com células primárias cultivadas.
Para estudar a função cerebral in vivo , emprega-se o modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) do mouse. A artéria cerebral média é bloqueada pela inserção de um monofilamento inflamado através da artéria carótida comum. Como um dos modelos de AVC mais amplamente utilizados, o modelo MCAO mostra relevância clínica e a aplicação de um monofilamento torna mais fácil a reperfusão. Simplesmente pela inalação de gases mistos normoxicos contendo 20% de CO 2 após o início do reperfusioN, a APC mostrou efeitos protetores significativos contra a isquemia cerebral indicada por volumes reduzidos de infarto cerebral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui apresentamos dois modelos experimentais para estudar a neuroproteção de APC contra isquemia cerebral. Em fatias de cérebro, a APC é conseguida através da incubação de fatias corticostriatais de camundongos em tampão ácido borbulhado com 20% de CO 2 após o início da reperfusão, enquanto que no modelo MCAO, a APC é conseguida inalando 20% de CO 2 para ratos após reperfusão. Ambos os modelos refletem a neuroproteção da APC contra a isquemia cerebral. A proteção foi comparável …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 e 81402907), Fundação Provincial de Ciências Naturais de Zhejiang (LR15H310001) e o Programa para a equipe líder de Zhejiang da equipe de inovação S & T (2011R50014).
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C5080 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride | Sigma | T8877 | |
| Absolute Ethanol | Aladdin Industrial Corporation | E111993 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Laser Doppler Flowmetry | Moor Instruments Ltd | Model Moor VMS-LDF2 | |
| Diethyl ether anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 80059618 | |
| Trichloroacetaldehycle hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 30037517 | |
| 10% Formalin | Aladdin Industrial Corporation | F111936 | |
| 24-well plates | Jet Biofil | TCP-010-024 |
Referenzen
- Zhao, H., Sapolsky, R. M., Steinberg, G. K. Interrupting reperfusion as a stroke therapy: ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (9), 1114-1121 (2006).
- Leconte, C., et al. Delayed hypoxic postconditioning protects against cerebral ischemia in the mouse. Stroke. 40 (10), 3349-3355 (2009).
- Fan, Y. Y., et al. Transient lack of glucose but not O2 is involved in ischemic postconditioning-induced neuroprotection. CNS Neurosci Ther. 19 (1), 30-37 (2013).
- Hess, D. C., Hoda, M. N., Bhatia, K. Remote limb perconditioning [corrected] and postconditioning: will it translate into a promising treatment for acute stroke. Stroke. 44 (4), 1191-1197 (2013).
- Ren, C., Yan, Z., Wei, D., Gao, X., Chen, X., Zhao, H. Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats. Brain Res. 1288, 88-94 (2009).
- Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K(ATP) channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (5), 851-859 (2012).
- Li, P., et al. Remote limb ischemic postconditioning protects mouse brain against cerebral ischemia/reperfusion injury via upregulating expression of Nrf2, HO-1 and NQO-1 in mice. Int J Neurosci. , 1-8 (2015).
- Fan, Y. Y., et al. A novel neuroprotective strategy for ischemic stroke: transient mild acidosis treatment by CO2 inhalation at reperfusion. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 275-283 (2014).
- Shen, Z., et al. PARK2-dependent mitophagy induced by acidic postconditioning protects against focal cerebral ischemia and extends the reperfusion window. Autophagy. , (2017).
- Skolnik, J., Takacs, L., Szende, E. In vitro oxygen consumption of slices from kidney, brain, cortex and liver in hypoxia. Nature. 209 (5020), 305 (1966).
- Lynch, G., Schubert, P. The use of in vitro. brain slices for multidisciplinary studies of synaptic function. Annu Rev Neurosci. 3, 1-22 (1980).
- Zheng, S., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces purkinje cell death in an in vitro model of rat cerebellar ischemia. Neurowissenschaften. 118 (1), 99-106 (2003).
- Yin, B., Barrionuevo, G., Weber, S. G. Optimized real-time monitoring of glutathione redox status in single pyramidal neurons in organotypic hippocampal slices during oxygen-glucose deprivation and reperfusion. ACS Chem Neurosci. 6 (11), 1838-1848 (2015).
- Medvedeva, Y. V., Ji, S., Yin, H. Z., Weiss, J. H. Differential vulnerability of CA1 vs CA3 pyramidal neurons after ischemia: possible relationship to sources of Zn2+ accumulation and its entry into and prolonged effects on mitochondria. J Neurosci. , (2016).
- Pignataro, G., et al. In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke: ischemic postconditioning. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 232-241 (2008).
- Zhang, X., Ding, H. Z., Jiang, S., Zeng, Y. M., Tang, Q. F. An in vitro study of the neuroprotective effect of propofol on hypoxic hippocampal slice. Brain Inj. 28 (13-14), 1758-1765 (2014).
- Niu, Y., et al. Chemical profiling with HPLC-FTMS of exogenous and endogenous chemicals susceptible to the administration of chotosan in an animal model of type 2 diabetes-induced dementia. J Pharm Biomed Anal. 104, 21-30 (2015).
